蛹期薜荔榕小蜂的人工气候箱培养

赵 萌，吴文珊，陈友铃，陈杨菲

(福建师范大学生命科学学院，福建省发育与神经生物学重点实验室，福州 350108)

薜荔FicuspumilaL. var.pumila属荨麻目Urticales桑科Moraceae榕属Ficus常绿攀援藤本植物，广泛分布于我国长江以南各个省区，是热带和亚热带植物生态系统的关键树种(张秀实和吴征镒, 1998)。薜荔食用部分富含果胶、蛋白质、维生素及矿质元素等养分(吴文珊和方玉霖, 1999)，是开发低脂低热保健饮品的首选资源且具有广阔的开发利用前景(陆春等, 2007; 秦爱文等, 2016)，但薜荔结实依赖膜翅目Hymenoptera榕小蜂科Agaonidae的薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae(Hill) Wiebes，没有榕小蜂造访的薜荔花序必将凋落，而薜荔榕小蜂也依赖薜荔雄花序的瘿花做为繁育后代的场所，一方消亡将导致另一方的绝灭，二者之间为互惠共生关系(马炜梁等, 1997)。薜荔雌、雄株一年产生1～3次花序，不同植株、植株所处生境和地理位置以及年气候条件均影响植株产生花序的批次(何坤耀, 1991; 陈勇等, 2002)，只有当雌、雄花序的雌花期与雄花序的小蜂出飞期一致时，雌株才能结实，小蜂才能完成繁殖(Harrison, 2003; Cook and Rasplus, 2003; 张媛等, 2016)，但野生状态下，时常出现小蜂出飞期滞后于花序雌花期的现象，从而导致大量落果。本研究利用人工气候箱对蛹期薜荔榕小蜂进行培养，探究温度对小蜂发育和出飞率的影响，以期缩短小蜂的发育时长，为蜂源缺失的榕树花序提供人工培养的雌蜂，维持榕-蜂共生体系的稳定，并为植食性寄生蜂的培养提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 野生薜荔榕小蜂及虫瘿发育观测

薜荔榕小蜂为薜荔的传粉小蜂，样品采集于福州闽侯镇(119°12′E, 26°01′N)。

2019年8月初，对新生长的薜荔雄花序进行标记，并选取其中的90个用100目的尼龙网袋(20 cm×20 cm)罩住以阻止小蜂进入薜荔果实干扰实验，每天观察花序发育状态，8月31日隐头花序的苞口开始松动，果内散发出芳香气味，表明花序小花开放进入雌花期，于是打开网袋，每果放入15头小蜂产卵，以小蜂进入榕果产卵的时间为准，翌日统计每果进蜂数，共获得产卵薜荔雄果88个。此后，每7 d随机采摘3个已被产卵的雄果，用密封袋装好带回实验室，将其纵向剖开，随机取30个虫瘿在立体显微镜下解剖，用解剖针将虫瘿划开并取出小蜂，置于载玻片上，使用显微镜观察并记录小蜂发育过程中的形态变化及虫瘿表皮层、保护层、内皮层的形态变化，监测榕小蜂发育期，并对以下数据进行统计：

(1)小蜂发育成熟度：将榕小蜂发育分为 6个阶段：预蛹、初期蛹、中期蛹、成熟蛹、羽化成虫(虫瘿内)，出飞成虫。为了能够更加直观地在图表中反映出其发育程度，分别用1～6依次为各发育阶段赋值，则发育成熟度为实验小蜂的各发育阶段的平均值(每隔7 d测定一次)；

(2)虫瘿壳含水率的测定：每隔14 d测定一次，将剔除榕小蜂后的虫瘿壳(最后一次测定是收集榕小蜂羽化离开虫瘿后第1天上午10时的虫瘿壳)立即置于2 mL指形管内，防止水分流失，每管10个虫瘿，共三组，使用分析天平称量，记录烘干前虫瘿壳重量，随后置于80℃烘箱内烘干至恒重后，记录虫瘿烘干后重量。虫瘿含水率(%)=(烘干前虫瘿壳重量-烘干后虫瘿壳重量)/烘干前虫瘿壳重量×100；

(3)羽化期榕小蜂陆续离开虫瘿，出飞5 d后，统计：

雌(雄)蜂出飞率(%)=雌(雄)蜂出飞数/雌(雄)蜂总数×100

雌(雄)蜂未出飞率(%)=雌(雄)蜂未出飞数/雌(雄)蜂总数×100

总出飞率(%)=(雌蜂出飞数+雄蜂出飞数)/ 虫瘿总数×100

(4)雌蜂寿命：在榕小蜂出飞的第1天上午，用120目的绢纱网袋分别收集野生未携粉出飞的雌蜂(去除果内雄蕊)与携粉出飞的雌蜂。在直径9 cm的培养皿中放置1张无菌滤纸，在滤纸上分散滴加2%无菌水配制的蜂蜜液100 μL，用毛笔将小蜂放入培养皿中，并用封口膜密封，根据薜荔榕小蜂最佳贮藏条件(戴志聪等, 2010)，将其置于10℃恒温箱中。分别在8 ∶ 00、16 ∶ 00和24 ∶ 00对小蜂进行观察，记录死亡数量与活性。每个培养皿60有小蜂，重复6次。

雌蜂的平均寿命=∑Li/N,Li为第i头雌蜂寿命，N为雌蜂总数。

利用Excel 2016和SPSS 21.0软件进行实验数据分析，利用单因素方差分析(one-way ANOVA)实验数据的差异显著性，以P值检验。

1.2 蛹期薜荔榕小蜂的人工气候箱培养

2019年11月11日，镜检表明薜荔榕小蜂已发育至预蛹期，采集携蜂榕果50个带回实验室，用5% NaClO溶液对薜荔榕果进行30 min浸泡后，用75%酒精擦拭，并立即用刀片纵切将其均分为4瓣，随机抽取一部分虫瘿镜检，进一步确认果内薜荔榕小蜂的发育状态(剔除小蜂发育非预蛹期的薜荔果)。分别选取15个果(60瓣)将其编号后，平铺在26℃、28℃、30℃(已通过薜荔榕小蜂的琼脂培养的预实验，对22～32℃范围的温度进行筛选)人工气候箱内(无光照，依据自然状态下的幼期榕小蜂生存于高湿度的榕果中，相对湿度设定为90%±5%)。每3 d对虫瘿进行一次镜检，每次分别从各温度处理的果中随机取30粒虫瘿，观察小蜂的发育状况以及虫瘿的形态特征。待第1头雄蜂从其中一瓣果出飞后，立即将它与其余3瓣重新合并(28℃保留5个果、共20瓣不合并)，单果放入120目的绢纱网袋(防止小蜂逃逸)，待无小蜂出飞时，将榕果内虫瘿分为内、外两层，外层厚度为3 mm，分别统计榕果内、外层的虫瘿数量与已出飞小蜂数量，并计算内、外层的小蜂出飞率：内(外)层出飞率(%)=内(外)层小蜂出飞数 / 内(外)层虫瘿数×100；统计雌、雄蜂的出飞数量和虫瘿总数，并借助体视显微镜观察记录未出飞的小蜂的发育状况。计算1.1中的各项，但每3 d测定一次小蜂发育成熟度，每6 d测定一次虫瘿含水率，其余采样周期不变。

1.3 雌蜂自主出飞率研究

野生自然条件下，在小蜂即将出飞时，采集3个雄花序带回实验室备用。切开榕果用镊子将内含雌蜂的虫瘿(雌蜂黑色，雄蜂棕色，成虫颜色能透出虫瘿，供判断)取下30粒，分别装入0.5 mL PCR管内(每管1粒，并将蘸有蒸馏水的无菌滤纸条一并放入，起保湿作用)，设5个重复。其余榕果切成相等的9块(虫瘿集生于果瓣上)，分别将含雄成虫的虫瘿去除，装入放有湿润无菌棉条的广口瓶中，室温下观察，2周后待小蜂全部死亡，统计已出飞雌蜂数量、咬破虫瘿但未出飞的雌蜂(图1)数量，以及未咬破虫瘿的雌蜂数量，计算雌蜂出飞率，并与1.1中野生雌蜂(整果)出飞率进行比较。

图1 咬破虫瘿但未能出飞的雌蜂Fig.1 Female wasp bit through the gall but failed to fly out

2 结果与分析

2.1 温度对小蜂发育及出飞的影响

28℃培养条件下，薜荔榕小蜂从预蛹至出飞的发育时长为27 d，较26℃提早3 d出飞，比同期野生小蜂提早53 d(图2)；28℃培养条件下，雄蜂的出飞率与26℃无显著差异(P>0.05)，但28℃的雌蜂出飞率极显著高于26℃(P<0.01)(表1)。雄蜂出飞时若将切分开的榕果果瓣合并，可提高24.27%的雌蜂出飞率，雄蜂出飞率无显著差异(P>0.05)。比较28℃条件下果瓣内外层的小蜂总出飞率，内层80.56%，而外层仅38.91%，差异极显著(P<0.01)，这可能由于外层虫瘿易脱水，导致虫瘿壳硬化，给小蜂的破壳造成的困难。

30℃条件下，榕小蜂在预蛹、初期蛹和中期蛹发育阶段的死亡率分别为16.67%、33.33%和51.67%，尽管有近一半的小蜂(48.33%)能发育至成熟蛹阶段，但在4 d内全部死亡，未能羽化。推测30℃可能是薜荔榕小蜂的高温耐受性极限，小蜂对高温的耐受性存在个体差异。

表1 不同温度条件下羽化期榕小蜂的出飞率及虫瘿内未出飞小蜂的发育状态(%)Table 1 Eclosion rate of wasps in emergence period and developmental condition of wasps in galls at different temperatures

图2 温度对蛹期薜荔榕小蜂发育的影响Fig.2 Effect of temperatures on the development of W. pumilae at the pupal stage

2.2 人工气候箱培养下的虫瘿壳含水率及结构变化

对虫瘿壳含水率进行测定，结果表明，28℃时虫瘿含水率下降最快(图3)，但28℃培养下小蜂的出飞时间比26℃提早3 d，导致28℃小蜂出飞时的虫瘿含水率(16.78%)极显著高于26℃(13.16%)，推测26℃条件下雌蜂的出飞率极显著低于28℃的原因，是小蜂所在虫瘿壳的低含水率增加了其破壳出飞的难度。

图3 不同温度条件下的虫瘿含水率Fig.3 Water content of galls at different temperatures

虫瘿壳分为：表皮层、保护层和内皮层(图4-A)，虫瘿腔被小蜂占据。野生初蛹期的虫瘿表皮层呈浅黄色，湿润且柔软；保护层呈米白色且富有弹性，为虫瘿腔内的蛹提供良好的生存发育空间；内皮层呈褐色，质感湿润柔软；羽化成虫阶段表皮层变为浅褐色，略有脱水，依然较为湿润，保护层无明显变化，内皮层无颜色变化，但因失水质感较脆(图4-B)；人工气候箱培养条件下，初蛹期的虫瘿表皮层呈黄色，但明显较薄(与野生型比较)，而保护层和内皮层无明显变化(图4-C)；羽化成虫阶段表皮层极度干燥，紧贴在保护层上，而保护层几乎失去弹性，硬度极大；内皮层干硬，易碎成粉末状(图4-D)。

图4 野生和人工气候箱培养条件下初蛹期及羽化成虫阶段的虫瘿壳结构比较Fig.4 Comparison of structure of gall shell at the primary pupal and emerged adult stages in the wild and in the artificial culture within climate incubator注：A-B，野生初蛹期和羽化成虫阶段虫瘿壳结构；C-D，人工气候箱培养初蛹期和羽化成虫阶段虫瘿壳结构；Ep，表皮层；Pl，保护层；En，内皮层；比例尺= 0.25 mm。Note: A-B, Structure of the gall shell at primary pupal and emerged adult stages in the wild; C-D, Structure of the gall shell at primary pupal and emerged adult stages in the climate incubator; Ep, Epdidermis; Pl, Protective layer; En, Endodermis; Scale bar=0.25 mm.

2.3 雌蜂自主出飞的可能性

无雄蜂条件下，单粒与集生虫瘿的雌蜂出飞率均极显著低于野生组(表2)，表明雌蜂具备自主出飞的能力，但破壳效率低，同时也表明雄蜂在雌蜂所在的虫瘿上开掘的交配孔有助于雌蜂扩孔出飞，可大幅提高雌蜂出飞率。

单粒虫瘿的雌蜂出飞率低于集生虫瘿的原因在于：单粒虫瘿中存在雌蜂已咬破虫瘿但未能出飞的现象(9.33%)，这可能是因为虫瘿未被固定，雌蜂破壳更耗体力；或可能是单粒虫瘿更易于脱水，虫瘿壁较硬，小蜂活性更弱的缘故。这也正是人工气候箱培养时，在羽化期将开瓣的薜荔再合并成整果可提高雌蜂交配率、出飞率的原因。

2.4 雌蜂寿命比较

对野生携粉、不携粉出飞和人工培养出飞的雌蜂寿命进行比较(图5)，结果表明：小蜂平均寿命依次为10.8、9.0、8.7 d，野生携粉出飞的小蜂寿命极显著长于野生不携粉出飞和人工培养的小蜂(P<0.01)，后二者之间的平均寿命无显著差异(P>0.05)，表明花粉可能对延长小蜂寿命有重要作用。

野生携粉出飞、不携粉出飞以及人工培养的雌蜂在前4 d未出现死亡(图5)，且活力较强，因而在小蜂野外放飞应用过程中，小蜂储存和运输的时间若能控制在4 d以内则效果最佳。

表2 雌蜂自主出飞率与未出飞雌蜂所在的虫瘿状态(%)Table 2 Independent eclosion rate of female wasps and gall state with female wasps not flying out

图5 野生与人工培养薜荔传粉雌蜂的存活曲线Fig.5 Survival curve of female wasps of Wiebesia pumilae in the wild and in artificial culture

3 结论与讨论

薜荔榕小蜂生活在榕树雌花子房形成的虫瘿内，羽化小蜂必须咬破虫瘿壳才能离开寄主(Anstett, 2001; Yang, 2002)，因此小蜂能否顺利出飞是人工培养成败的标志，而影响出飞的原因主要有：(1)培养过程中虫瘿壳含水率的下降，导致虫瘿壳硬化，造成榕小蜂开凿虫瘿壁的难度增大，阻碍雌、雄蜂出飞，同时，也导致虫瘿内环境湿度降低，影响小蜂的活力与寿命(Patinoetal., 1996; Dunnetal., 2008)。尽管设置了高湿度(RH90%)培养条件，但28℃、27 d的长培养周期仍旧导致虫瘿壳的严重脱水，因此，如何提高虫瘿含水率是亟待克服的技术瓶颈。(2)雌蜂出飞依赖于雄蜂，即雄蜂先于雌蜂钻出虫瘿，通过嗅觉感知雌蜂产生的气味信息寻找虫瘿内未出飞的雌蜂(Ortiz-Barrientosetal., 2004; Krishnanetal., 2014; Liuetal., 2019)，雄蜂开凿交配孔并与雌蜂交配(Howard and Blomquist, 2005；Nagamotoetal., 2005)，而后雌蜂扩大交配孔后出飞。本试验结果表明，在没有交配孔的情况下，雌蜂的自主出飞率低于15%，在28℃雄蜂出飞期果瓣不合并条件下的雌蜂出飞率为27.63%，果瓣合并可使雌蜂出飞率达到51.90%，推测果瓣开放导致部分已出虫瘿的雄蜂掉落在瓣外，为雌蜂开凿交配孔的雄蜂数量减少；同时开放系统削弱了雌蜂产生的气味，降低了雄蜂对雌蜂精确定位的效率，从而导致雌蜂出飞率下降。(3)尽管28℃培养缩短了蛹期薜荔榕小蜂发育时长，但并不是薜荔榕小蜂成虫生存的最适温度，由于一定温度范围内，榕小蜂寿命随温度降低而延长(戴志聪等, 2010)。因此，建议将榕小蜂发育至成熟期的榕果转至相对较低的温度环境中(例如，22℃或25℃)，既延长榕小蜂寿命，提高榕小蜂活力(提高打洞能力)，也有利于虫瘿提高含水量(易被榕小蜂打穿)，从而提高榕小蜂的出飞率。