黑水虻幼虫蛋白及其酶解产物的抗氧化活性研究

李 鑫，周鹏飞，周东来，杨 琼，邝哲师

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广州 510610)

在生命体中，机体的氧化与抗氧化一般处于一种动态的平衡，随着细胞代谢的进行，机体会产生具有高氧化活性的自由基，如果自由基产生过多或清除较少，可能会导致机体处于氧化应激状态(Gülçin, 2012; Lietal., 2015)。研究表明这种氧化应激状态会导致细胞自噬、凋亡，并引起组织的不可逆损伤(Shenetal., 2017)。常用的化学合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯(PG)、丁基羟基甲苯(BHT)和叔丁基氢醌(TBHQ)等(张强, 2020)，及天然抗氧化物质如抗坏血酸(Vc)、谷胱甘肽(GSH)以及一些酶类(张泽生等, 2017)。尽管化学合成的抗氧化物质具有高效、廉价的特点，但是其潜在的安全隐患，使其应用受到限制，因此人们把更多的关注转移到天然抗氧化物质。

近年来，大量研究证明昆虫蛋白及昆虫水解蛋白具有较强的抗氧化特性，如丰年虫Chirocephalusdiaphanous(聂路等, 2011)、大麦虫Zophobasmorio(郭倩等, 2011)、黑水虻Hermitiaillucens(许彦腾等, 2014)、蜜蜂Apismellifera(Dongetal., 2016)、编织蚁Oecophyllasmaragdina(Werawichetal., 2017)等。

黑水虻Hermitiaillucens，英文名为Black soldier fly，学名为亮斑扁角水虻，是双翅目Diptera水虻科Stratiomyidae的一种陆生、营腐食性生活的昆虫(柴志强等, 2012; 沈媛等, 2012)。目前对黑水虻的研究主要集中在黑水虻幼虫饲养、畜禽粪便处理、饲用价值开发等方面(邓文辉等, 2019; 袁橙等, 2019; 陈柏宇等, 2020)。近些年来部分学者开始对黑水虻幼虫蛋白(black soldier fly larva proteins, BSFLP)制备(陈苏婉等, 2019; 朱定等, 2020)与抗氧化活性进行研究(许彦腾等, 2014)，而基于BSFLP及其酶解产物的抗氧化活性研究较少。本文以鲜活黑水虻幼虫冻虫为对象，采用碱提酸沉法制备黑水虻幼虫蛋白，并通过碱性蛋白酶(Alkaline)、菠萝蛋白酶(Bromelain)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、木瓜蛋白酶(Papain)对其蛋白质溶液进行酶解，分别从ABTS自由基、羟自由基、DPPH自由基3个方面对黑水虻蛋白及其酶解液的抗氧化能力进行测定，旨在初步了解黑水虻蛋白及其酶解产物的抗氧化能力，为黑水虻抗氧化肽的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑水虻幼虫购自广西上林县方圆农资店；定量(TP)测定试剂盒(BCA法)、DPPH自由基清除能力试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)测试盒(ABTS法)、羟自由基测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；碱性蛋白酶(Alkaline)、菠萝蛋白酶(Bromelain)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、木瓜蛋白酶(Papain)购自上海源叶生物科技有限公司；Vc(标准品)购自广州市齐云生物技术有限公司；氢氧化钠、浓盐酸、冰醋酸、无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；HZQ-X300C恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；SIGMA-3K15高速冷冻离心机，德国SIGMA仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-3E pH计，上海雷磁仪器有限公司；Synergy H4多功能酶标仪，美国BioTek仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1样品制备

取新鲜黑水虻5龄幼虫适量，置于冰箱冷冻，将冰冻幼虫使用粉碎机粉碎，制成虫浆后于-20℃冰箱中冷冻保存。取上述冷冻虫浆适量，于50℃烘箱中干燥48 h后去除杂质，置于打粉机中研碎，过60目筛网，制成虫粉作为送检样品。

1.3.2BSFLP粗提液的制备

参照许彦腾等(2014)的方法并略有改动，取适量冷冻虫浆，放入锥形瓶中，按照料液比1 ∶ 22加入0.61 mol/L 氢氧化钠溶液，在53.2℃，200 r/min的条件下摇床反应2 h。将提取液通过纱布进行过滤，除去虫浆中的部分不溶物，将过滤好的提取液转入离心管中进行离心(8 000 r/min)10 min。离心结束后取上清液，并用1 mol/L 盐酸调节pH至等电点4.8。离心(8 000 r/min)10 min，提取沉淀并用去离子水复溶，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，获得BSFLP粗提液，保存于-20℃冰箱备用。

1.3.3BSFLP的酶解

将适量BSFLP溶液加入试管，放入水浴锅中，调节水浴锅的温度使其达到适宜酶解温度。用NaOH或HCl调节到适当的pH，并按照比例加入适量的蛋白酶，酶解条件见表1(朱作艺等, 2020)。酶解结束后，将BSFLP酶解液放入100℃水浴锅中迅速灭酶10 min，冷却后，8 000 r/min离心10 min，取上清液。

表1 4种蛋白酶的酶解条件

1.3.4蛋白质含量测定

BSFLP和4种蛋白酶酶解液的蛋白质含量测定均按照试剂盒说明书进行。

1.3.5抗氧化活性的测定

分别配置不同浓度的BSFLP和4种蛋白酶酶解液，并采用Vc作为阳性对照。BSFLP和4种蛋白酶酶解液对ABTS自由基、羟自由基、DPPH自由基的清除能力测定均按照试剂盒说明书进行。

1.3.6黑水虻幼虫蛋白质的氨基酸组成测定

黑水虻幼虫粉送至广东省分析测试研究所作氨基酸组分分析，测定参照中华人民共和国国家标准(GB 5009.124-2016)中的方法进行，采用氨基酸分析仪(茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪)测定黑水虻中的16种水解氨基酸。

1.4 数据处理及分析

所有实验均重复3次，结果取平均值，实验结果以平均数±标准差进行表示。采用SPSS 19.0软件进行分析，Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 BSFLP的氨基酸组成分析

BSFLP的氨基酸组成，委托广东省分析测试研究所(中国广州分析测试中心)进行测定，测定结果如表3所示。在测定的16种氨基酸中，通过计算得出疏水性氨基酸的占比为39.8%，此外在测定的16种氨基酸中，谷氨酸(GLU)含量占比最高，为18.3%，其次为天冬氨酸(ASP)，占氨基酸总体含量的10.1%。

表2 黑水虻幼虫的氨基酸组成

2.2 BSFLP的抗氧化活性

2.2.1总抗氧化能力(ABTS法)

BSFLP溶液和Vc对ABTS自由基的清除率随着浓度的增加而增大，且呈现出一定的剂量效应。在0～0.2 mg/mL浓度范围内，Vc溶液对ABTS自由基的清除率随着溶液浓度的增加而显著增加，在浓度达到0.2 mg/mL后，增长速率趋于平缓，最大清除率为91.3%。对Vc进行多项式模型拟合，拟合方程为：Vc y=-857.748x2+612.987x-0.923(R2=0.996)，通过拟合方程计算计算出Vc的半抑制浓度(IC50)(0.96 mg/mL)。BSFLP溶液对ABTS自由基的清除率随着溶液质量浓度的增加而增加，表现出明显的剂量效应关系。对BSFLP进行多项式拟合，其拟合方程为：BSFLP y=-1.435x2+20.902x+1.309(R2=0.997)，通过拟合方程的计算出BSFLP的IC50(2.91 mg/mL)(图1)。

图1 BSFLP的ABTS自由基清除能力Fig.1 ABTS radical scavenging activity of Hermetia illucens larvae protein

2.2.2羟自由基清除活性

阳性对照Vc在0.05～0.5 mg/mL范围内，对羟自由基的清除率随着溶液质量浓度的增加而增加，呈现出良好的线性关系，线性拟合方程为：Vc y=173.333x+5.867(R2=0.994)，通过拟合方程得到Vc的IC50(0.229 mg/mL)。BSFLP溶液对羟自由基的清除率随着质量浓度的增加而逐渐上升，但增加速度逐渐趋于平缓。对BSFLP进行多项式模型拟合，其拟合方程为：BSFPL y=-225.789x2+259.613x+1.787(R2=0.926)，通过拟合方程得到BSFLP的IC50为0.232 mg/mL，与阳性对照Vc的IC50接近(图2)。

图2 BSFLP的羟自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of Hermetia illucens larvae protein

2.2.3DPPH自由基清除活性

BSFLP溶液和阳性对照Vc随着质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率逐渐增加，BSFLP溶液在0～2.5 mg/mL的范围内的清除率与溶液浓度基本呈线性关系，其线性拟合方程为：BSFLP y=25.366x+21.794(R2=0.915)，通过拟合方程计算其IC50为0.794 mg/mL。阳性对照组Vc在0～0.025 mg/mL范围内剂量效应明显，当质量浓度达到0.05 mg/mL时，清除率趋于平缓且达到最大值(95%)。对Vc进行多项式模型拟合，其拟合方程为：Vc y=-18160.383x2+2539.281x+21.232(R2=0.916)，通过拟合方程计算其IC50为0.0124 mg/mL。相比于阳性对照Vc，BSFLP表现出的抗氧化活性一般(图3)。

图3 BSFLP的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Hermetia illucens larvae protein

2.3 BSFLP酶解液的抗氧化活性

2.3.1总抗氧化能力

BSFLP溶液和风味蛋白酶酶解液(Flavourzyme enzymatic hydrolysate, Feh)、菠萝蛋白酶酶解液(Bromelain enzymatic hydrolysate, Beh)、碱性蛋白酶酶解液(Alkaline enzymatic hydrolysate, Aeh)、木瓜蛋白酶酶解液(Papain enzymatic hydrolysate, Peh)均表现出一定的ABTS自由基清除能力，且都随着溶液质量浓度的增加，清除率不断增加。然而当浓度达到某一特定值时(如Feh，当质量浓度达到0.5 mg/mL时清除率增加速率趋于平缓)，清除速率的增加开始变慢。对BSFLP溶液和酶解液进行多项式模型拟合，得到的多项式模型分别为BSFLP：

y=1.09+20.92x-1.435x2(R2=0.997)

Feh：y=33.81+60.105x-17.77x2(R2=0.996)

Beh：y=20.61+35.289x-5.811x2(R2=0.996)

Aeh：y=19.791+21.962x-2.65x2(R2=0.995)

Peh：y=20.33+25.195x-3.72x2(R2=0.982)

通过拟合方程计算出BSFLP溶液和4种酶解液的IC50分别为BSFLP IC50(2.91 mg/mL)、Feh IC50(0.295 mg/mL)、Beh IC50(0.996 mg/mL)、Aeh IC50(1.733 mg/mL)、Peh IC50(1.51 mg/mL)。BSFLP和4种酶解液的ABTS自由基清除能力大小顺序为：Feh>Beh>Peh>Aeh>BSFLP，其中4种酶解液的ABTS自由基清除能力均高于BSFLP溶液，清除能力最强的Feh约为BSFLP溶液ABTS自由基清除能力的9.86倍，因此酶解液具有更强的ABTS自由基清除能力(图4)。

图4 酶解液的ABTS清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate

2.3.2羟自由基清除能力

BSFLP溶液和Feh、Beh、Aeh、Peh均表现出一定的羟自由基清除能力，且随溶液质量浓度的增加，清除能力逐渐增强。Feh、Aeh、Peh 三种酶解液中，当质量浓度达到一定值时，羟自由基的清除率增加速度趋于平缓，当质量浓度为0.5 mg/mL时，Peh的清除率达到最大值(80%)。对BSFLP溶液和4种酶解液进行多项式模型拟合，得到的多项式模型分别为BSFLP：

y=1.787+259.6x-225.8x2(R2=0.976)

Feh：y=-12.287+211.093x-106.7x2(R2=0.965)

Beh：y=-9.887+223.598x-157x2(R2=0.993)

Aeh：y=-4.124+226.04x-132.511x2(R2=0.968)

Peh：y=31.483+207.509x-219.625x2(R2=0.987)

通过拟合方程计算出BSFLP溶液和4种酶解液的(IC50)分别为BSFLP IC50(0.232 mg/mL)、Feh IC50(0.36 mg/mL)、Beh IC50(0.357 mg/mL)、Aeh IC50(0.288 mg/mL)、Peh IC50(0.082 mg/mL)。BSFLP溶液和4种酶解液的羟自由基清除能力大小顺序为：Peh>BSFLP>Aeh>Beh>Feh。4种酶解液中只有Peh的羟自由基清除能力强于BSFLP溶液，约为BSFLP溶液羟自由基清除能力的2.82倍，其余的3种酶解液的羟自由基清除能力略低于BSFLP溶液(图5)。

图5 酶解液的羟自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate

2.3.3DPPH自由基清除能力

BSFLP溶液和Feh、Beh、Aeh、Peh均表现出一定的DPPH自由基清除能力，且随溶液质量浓度的增加，清除能力逐渐增加。对BSFLP溶液和4种水解溶液进行多项式模型拟合，得到的多项式模型分别为BSFLP：

y=12.132+59.246x-14.55x2(R2=1.00)

Feh：y=3.596+92.329x-23.109x2(R2=0.997)

Beh：y=11.176+137.317x-78.54x2(R2=0.995)

Aeh：y=4.738+64.746x-14.292x2(R2=0.997)

Peh：y=7.531+92.338x-29.093x2(R2=0.998)

通过拟合方程计算出BSFLP溶液和4种酶解液的IC50分别为BSFLP IC50(0.794 mg/mL)、Feh IC50(0.589 mg/mL)、Beh IC50(0.354 mg/mL)、Aeh IC50(0.862 mg/mL)、Peh IC50(0.558 mg/mL)。BSFLP溶液和4种酶解液的羟自由基清除能力大小顺序为：Beh>Peh>Feh>BSFLP>Aeh。4种酶解液的羟自由基清除能力大多数强于BSFLP溶液，其中Beh是BSFLP溶液DPPH自由基清除能力的2.24倍，因此，酶解液具有更好的DPPH自由基清除能力(图6)。

图6 酶解液的DPPH自由基清除活性Fig.6 DPPH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate

3 结论与讨论

3.1 BSFLP的抗氧化活性

ABTS经氧化后产生稳定的蓝绿色ABTS水溶性自由基，抗氧化剂与ABTS自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光值降低，故待测样品的ABTS自由基清除活性可利用分光光度法进行测定，该方法具有操作简单、快速、高通量等优点(郑善元等, 2010)。本次实验结果表明BSFLP对ABTS自由基的IC50约为2.91 mg/mL，而蔡雨娇等(2020)对神农架蜂蜜的抗氧化能力研究中发现其ABTS的IC50约为48.48 mg/mL；朱作艺等(2020)在对蜂王浆蛋白肽的抗氧化能力研究中发现其ABTS的IC50约为14.18 mg/mL，IC50值均高于BSFLP。一般认为某种物质的IC50低于10.0 mg/mL时，说明其具有良好的抗氧化活性(郑义等, 2014)，因此BSFLP具有较好的ABTS自由基清除能力。

羟自由基被认为是毒性最强的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素(郭倩, 2011)。本次实验结果表明BSFLP对羟自由基的IC50约为0.232 mg/mL，明显低于相关文献报道的南美白对虾酶解肽(林丽英等, 2012)及家蝇蛹抗氧化肽(孙婷婷等, 2019)的羟自由基的IC50值。因此相比于常见的动物抗氧化肽，BSFLP具有较好的羟自由基清除活性。

DPPH是一种较为稳定的自由基，一般通过生物体的正常代谢形成。研究表明DPPH与生物体的衰老、各种炎症疾病及癌症都有一定的关系(闵建华等, 2019)。高涵等人(2019)在对几种常见测定抗氧化性方法的比对中发现DPPH法测定抗氧化能力时，其测定结果变异系数低、标准偏差小、精密度高。因此DPPH法可以作为一种测定抗氧化活性的常用方法。本次实验中，虽然BSFLP的DPPH自由基IC50明显高于对照组Vc，但其IC50显著低于文献报道的河蚬抗氧化肽(刘晶晶等, 2020)及三文鱼皮胶原低聚肽(刘文颖等, 2010)的IC50，因此BSFLP具有较好的DPPH自由基清除活性。

研究表明，蛋白质的抗氧化活性主要来源于具有抗氧化的氨基酸，因此蛋白质中的氨基酸组成是影响其抗氧化能力的重要要因素之一(Pengetal., 2009; Tang and Wang, 2012)。一般认为组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、等氨基酸具有较强的抗氧化活性(Saitoetal., 2003)。在本研究中，BSFPL中组氨酸(His)、亮氨酸(Tyr)含量较高，分别占BSFLP中氨基酸总量的5.9%、5.7%，因此BSFLP较强的抗氧化活性可能与此类氨基酸含量较高有关。此外，疏水性氨基酸含量较多的蛋白和多肽往往具有较高的抗氧化活性。葛晓鸣等人(2019)在对海马酶解多肽的研究中发现疏水性氨基酸对其抗氧化活性贡献较多。黄湛媛等人(2017)发现疏水性氨基酸结构对自由基清除有重要影响。这有可能是因为疏水性氨基酸可以通过提供氢受体，与其它氨基酸相互作用来增强多肽的疏水性，进而增加抗氧化能力(Chenetal., 2009)，也可能是疏水性氨基酸通过促进蛋白和多肽的脂溶性，从而提高其自由基清除能力(Najafian and Babj, 2014)。在本研究中，BSFLP的氨基酸组成中，疏水性氨基酸占比高达39.8%，其中脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)等疏水性氨基酸含量均较高，因此BSFLP中高含量的疏水性氨基酸对其抗氧化活性产生了重要影响。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是生物体内过氧化反应的最终产物，Femi等人(2020)在使用BSFLP替代鱼粉对罗非鱼的投喂试验中发现，随着BSFLP替代比例的增加，鱼体血清中MDA的含量逐渐降低，表明鱼体内的过氧化反应减少，从某种程度上证明了BSFPL的抗氧化活性，综上BSFLP具有良好的抗氧化活性。

3.2 BSFLP与酶解液的抗氧化活性

本次研究结果表明，酶解液对ABTS和DPPH自由基的清除能力均强于BSFLP溶液，而在羟自由基的清除实验中，仅Peh清除能力强于BSFLP溶液。出现这一结果的原因可能是由于BSFLP对ABTS、DPPH自由的清除基于电子转移法(SET)机制，而对羟自由基的清除基于氢转移(HAT)机制(Selgaetal., 2004; 朱作艺等, 2020)。

氢原子转移(HAT)和电子转移(SET)是两种不同的清除自由基机制(Prioretal., 2005)。在电子传递法(SET)的反应机制中，主要通过含半胱氨酸、色氨酸和组氨酸的肽段或氨基酸残基发挥作用。在氢原子转移(HAT)反应机制中，主要通过含酪氨酸的肽段或氨基酸残基发挥作用(Ashaoluetal., 2019)。因此根据4种酶解液对ABTS、DPPH自由基以及羟自由基表现出的不同清除能力，推断4种酶解液中，半胱氨酸、色氨酸和组氨酸为主要组成成分，而酪氨酸在酶解液的氨基酸组成成分中占比不高。

已有研究表明多肽的抗氧化活性与其分子大小、疏水性以及氨基酸组成和序列密切相关(Chaietal., 2017; Huetal., 2020)。在本次实验中4种蛋白酶由于酶切位点不同，酶解得到的多肽分子质量以及氨基酸残基也有所不同，因此表现出不同的抗氧化活性。如在对ABTS自由基的清除实验中，Feh表现出较强的自由基清除能力，其IC50约为(0.295 mg/mL)，是BSFLP溶液清除率的9.86倍。这可能是因为风味蛋白酶同时具有内切酶和外切酶的特点(刘丽君等, 2019)，因此在水解过程中得到了更多、更小的多肽分子和氨基酸残基。吴靖娜等人(2017)在对海马抗氧化肽的研究中也发现了类似的结果。在对DPPH自由基的清除实验中，Beh表现出较强的自由基清除活性，这可能与菠萝蛋白酶作用于疏水性氨基酸的羧基(C)末端有关，从而形成了更多疏水性氨基酸残基(吴茂玉等, 2008; 李荣乔, 2014; 王大巾等, 2016)。疏水性氨基酸是影响多肽抗氧化活性的关键因素之一，这些疏水性氨基酸残基能够促进多肽在脂质-水界面处的溶解，从而更好地发挥清除自由基的作用(Wongetal., 2020; Yangetal., 2020)。Aeh的自由基清除能力低于BSFLP溶液，刘天红等人(2019)在对沙蚕酶解产物的抗氧化研究中也发现了类似的结果。其原因可能是，酶解产物的小肽被过度水解，导致其丧失部分功能键，进而降低了酶解液中小肽的抗氧化活性。

综上所述，经蛋白酶处理过的大多数蛋白肽具有更强的抗氧化能力，对ABTS自由基、羟自由基、DPPH自由基有着更好的清除能力。本次实验证明了酶解制备抗氧化肽的可行性，为今后利用昆虫蛋白肽作为一种新型饲料添加剂提供了一定的研究基础，同时也为无抗饲料以及昆虫资源化利用提供了新的研究思路。