miR-223调控NLRP3∕Caspase-1通路在氯胺酮诱导发育期大鼠海马神经元焦亡中的作用

张洪江 李树霞 翁洪亮

临沂市中心医院1麻醉科，2病理科（山东临沂 276400）

氯胺酮作为N-甲基-D-天冬氨酸受体的非竞争性阻断剂，可抑制神经干细胞增殖，造成大脑神经元变性与凋亡［1］。有研究表明氯胺酮能够通过激活NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（nod-like receptor pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）∕含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）途径诱导海马细胞凋亡［2］。NLRP3∕Caspase-1 通路其激活可诱导细胞焦亡的发生。微小RNA-233（miR-223）参与未成熟神经元的分化，并可通过调控谷氨酸受体发挥神经保护作用［3］。研究发现miR-223 可通过抑制NLRP3 表达来抑制热性惊厥大鼠海马组织NLRP3∕Caspase-1信号通路的激活，从而抑制神经元凋亡［4］。本研究意在探究miR-223 是否可通过调控NLRP3∕Caspase-1 通路改善氯胺酮诱导的发育期大鼠海马神经元焦亡，以期为氯胺酮诱导的神经损伤的治疗机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 福建医科大学所购买的7日龄雄性SPF 级SD 大鼠50 只，许可证：SCXK（闽）2016-0002，泉城省实验室适应性饲养1周后（光照12 h∕d），于试验前夕进行禁食（12 h）。

1.2 主要试剂 HRP-IgG抗体、兔抗NLRP3、β-actin、GSDMD-N 抗体（货号：ab6721、ab214185、ab8227、ab215203，Abcam）；兔抗cleaved Caspase-1 抗体（货号：AF4022，Affinity Biosciences）；白介素18（Interleukin 18，IL-18）、白介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）试剂盒（货号：SEKH-0028、SEKR-0002，北京索莱宝科技有限公司）；全自动凝胶成像分析系统ZF-288（上海金鹏分析仪器有限公司）；Bio-Rad 伯乐CFX Connect 荧光定量PCR（上海土森视觉科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组与处理 大鼠分为对照组、氯胺酮组、agomir-NC 组、agomir-223 组、agomir-223+BAY11-7082 组（10 μmol∕L NLRP3 抑制剂BAY11-7082）［5］，10只∕组。除对照组外大鼠腹腔注射氯胺酮（80 mg∕kg）后，左侧侧脑室海马区注射生理盐水（4 μL），agomir-223+BAY11-7082 组并注射抑制剂，对照组大鼠腹腔及左侧侧脑室海马区均注射等量生理盐水［6］。

1.3.2 空间探索实验 平台设于第三象限，大鼠面朝池壁于第一象限下水，记录60 s 内大鼠寻找到平台的时间及轨迹，为期5 d 训练（1 次∕d）。于第6 d 撤掉平台，记录大鼠60 s 内潜伏期、第三象限停留时间及穿越次数，n=10。

1.3.3 HE 染色 空间探索实验结束后取大鼠（5 只）海马组织浸泡于4%多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋后连续进行切片（4 μm），再根据HE 染色试剂盒进行染色，脱水、封片后光镜下观察。

1.3.4 qRT-PCR 检测大鼠海马组织中miR-223 表达水平 取剩余5 只大鼠分离出海马组织，一部分提取总RNA，检测其纯度和浓度，2-ΔΔCt计算miR-223 表达，n= 5，另两部分分别用于ELISA 实验及Western blot 实验。

1.3.5 TUNEL 染色 石蜡切片孵育后进行DAB显色、苏木精复染、封片，光镜下选取5 个视野观察并拍照（n= 5），细胞计数（凋亡细胞呈现棕褐色），凋亡指数（apoptotic index，AI）（%）=（凋亡细胞∕总细胞）×100%。

1.3.6 ELISA 检测大鼠海马组织中IL-1β 及IL-18水平 ELISA 法测定各组1.3.4 所得海马组织中IL-1β 及IL-18 水平（n=5）。

1.3.7 Western blot 检测大鼠海马组织中NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 的表达情况 在1.3.3所得海马组织中加入裂解液，根据BCA法对蛋白浓度进行定量，蛋白样品（30 μg∕孔）加入SDSPAGE凝胶中进行垂直电泳，转膜后进行牛血清白蛋白封闭（5%），孵育兔抗NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N、β-actin（1∶1 000）抗体过夜（4℃）后孵育二抗（1∶1 000）2 h，加入ECL 显影液后在蛋白凝胶成像仪中显影观察，Image J 分析蛋白条带灰度值并计算含量（n=5）。

1.3.8 统计学方法 SPSS 18.0 对所有计量资料分析处理，以（）表示，ONE-WAY ANOVA 分析进行多组间计量资料比较，进一步两两比较使用SNK-q检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马组织中miR-223 表达水平 与对照组相比，氯胺酮组大鼠海马中miR-223 水平降低（P＜0.05）；与氯胺酮组相比，agomir-223 组miR-223 水平增加（P＜0.05），见表1。

表1 大鼠海马组织中miR-223 表达水平Tab.1 Expression level of miR-223 in rat hippocampus±s

注：与对照组相比，aP ＜0.05；与氯胺酮组相比，bP ＜0.05；与agomir-NC 组相比，cP ＜0.05；与agomir-223 组相比，dP ＜0.05

分组对照组氯胺酮组agomir-NC 组agomir-223 组agomir-223+BAY11-7082 组F 值P 值miR-223 1.00±0.04 0.36±0.05a 0.35±0.04a 0.87±0.10abc 0.86±0.08abc 107.998＜0.001

2.2 miR-223 对大鼠认知功能的影响 与对照组相比，氯胺酮组大鼠潜伏期增加，穿越平台次数及第三象限停留时间占比降低（P＜0.05）；与氯胺酮组相比，agomir-223 组潜伏期降低，穿越平台次数及第三象限停留时间占比增加（P＜0.05）；与agomir-223 组相比，agomir-223+BAY11-7082 组潜伏期降低，穿越平台次数及第三象限停留时间占比增加（P＜0.05），见表2。

表2 miR-223 对大鼠认知功能的影响Tab.2 Effect of miR-223 on cognitive function in rats ±s

表2 miR-223 对大鼠认知功能的影响Tab.2 Effect of miR-223 on cognitive function in rats ±s

注：与对照组相比，aP ＜0.05；与氯胺酮组相比，bP ＜0.05；与agomir-NC 组相比，cP ＜0.05；与agomir-223 组相比，dP ＜0.05

分组对照组氯胺酮组agomir-NC 组agomir-223 组agomir-223+BAY11-7082 组F 值P 值潜伏期（s）9.41±2.01 45.76±12.38a 43.75±11.40a 20.08±5.32abc 12.06±3.11abcd 46.500＜0.001穿越平台次数（次）3.52±0.34 1.01±0.32a 1.05±0.34a 2.29±0.40abc 2.99±0.26abcd 113.803＜0.001第三象限停留时间占比（%）33.52±4.85 11.24±3.90a 12.15±2.97a 21.25±4.38abc 29.22±3.02abcd 65.390＜0.001

2.3 大鼠海马组织病理学观察 对照组大鼠海马组织神经元排列整齐、结构完整、核膜核仁清晰可见；氯胺酮组大鼠海马神经元出现变性坏死现象、细胞间隙增加、间质与胶质细胞肿胀明显；与氯胺酮组相比，agomir-NC 组大鼠海马组织病理学程度无显著变化，agomir-223 组上述现象得到改善；与agomir-223 组相比，agomir-223+BAY11-7082 组大鼠海马神经元神经元细胞得到进一步改善，见图1。

图1 大鼠海马组织病理学观察（×200）Fig.1 Histopathological observation of rat hippocampus（×200）

2.4 miR-223 过表达对大鼠海马神经元凋亡的影响 与对照组相比，氯胺酮组大鼠海马神经元AI增加（P＜0.05）；与氯胺酮组相比，agomir-223 组AI降低（P＜0.05）；与agomir-223 组相比，agomir-223+BAY11-7082 组AI 降低（P＜0.05），见表3、图2。

图2 miR-223 过表达对大鼠海马神经元凋亡的影响（×200）Fig.2 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats

表3 miR-223 过表达对大鼠海马神经元凋亡的影响Tab.3 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats ±s

表3 miR-223 过表达对大鼠海马神经元凋亡的影响Tab.3 Effect of miR-223 overexpression on apoptosis of hippocampal neurons in rats ±s

注：与对照组相比，aP ＜0.05；与氯胺酮组相比，bP ＜0.05；与agomir-NC 组相比，cP ＜0.05；与agomir-223 组相比，dP ＜0.05

分组对照组氯胺酮组agomir-NC 组agomir-223 组agomir-223+BAY11-7082 组F 值P 值AI（%）3.24±0.26 38.46±12.42a 36.12±10.75a 20.48±2.79abc 10.70±1.51abcd 21.255＜0.001

2.5 miR-223 过表达对大鼠海马中IL-18、IL-1β水平的影响 与对照组相比，氯胺酮组大鼠海马中IL-18、IL-1β 水平增加（P＜0.05）；与氯胺酮组相比，agomir-223 组IL-18、IL-1β 水平降低（P＜0.05）；与agomir-223 组相比，agomir-223+BAY11-7082 组IL-18、IL-1β 水平降低（P＜0.05），见表4。

表4 miR-223过表达对大鼠海马中IL-1β及IL-18水平的影响Tab.4 Effects of miR-223 overexpression on the levels of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus ±s

表4 miR-223过表达对大鼠海马中IL-1β及IL-18水平的影响Tab.4 Effects of miR-223 overexpression on the levels of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus ±s

注：与对照组相比，aP ＜0.05；与氯胺酮组相比，bP ＜0.05；与agomir-NC 组相比，cP ＜0.05；与agomir-223 组相比，dP ＜0.05

组别对照组氯胺酮组agomir-NC 组agomir-223 组agomir-223+BAY11-7082 组F 值P 值IL-1β（pg∕mL）23.12±7.01 133.71±12.08a 128.95±10.86a 69.75±5.08abc 40.04±3.53abcd 181.734＜0.001 IL-18（pg∕mL）20.75±6.06 119.75±11.28a 114.84±8.30a 68.11±6.07abc 45.13±3.46abcd 165.627＜0.001

2.6 miR-223 过表达对大鼠海马组织中焦亡相关蛋白表达的影响 与对照组相比，氯胺酮组大鼠海马中NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 水平增加（P＜0.05）；与氯胺酮组相比，agomir-223 组NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 水 平 降 低（P＜0.05）；与agomir-223 组相比，agomir-223+BAY11-7082 组NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMDN 水平降低（P＜0.05），见表5、图3。

图3 miR-223 过表达对大鼠海马组织中焦亡相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus

表5 miR-223 过表达对大鼠海马组织中焦亡相关蛋白表达的影响Tab.5 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus ±s

表5 miR-223 过表达对大鼠海马组织中焦亡相关蛋白表达的影响Tab.5 Effect of miR-223 overexpression on the expression of focal death related protein in rat hippocampus ±s

注：与对照组相比，aP ＜0.05；与氯胺酮组相比，bP ＜0.05；与agomir-NC 组相比，cP ＜0.05；与agomir-223 组相比，dP ＜0.05

组别对照组氯胺酮组agomir-NC 组agomir-223 组agomir-223+BAY11-7082 组F 值P 值NLRP3∕β-actin 0.42±0.07 1.20±0.15a 1.16±0.19a 0.93±0.10abc 0.69±0.08abcd 33.714＜0.001 GSDMD-N∕β-actin 0.53±0.05 1.32±0.20a 1.30±0.18a 1.10±0.15acb 0.84±0.11abcd 25.530＜0.001 cleaved Caspase-1∕β-actin 0.61±0.09 1.45±0.23a 1.46±0.20a 1.23±0.22acb 0.93±0.10abcd 20.841＜0.001

3 讨论

氯胺酮等麻醉剂的使用会造成新生儿脑损伤，从而导致其成长期行为的改变［3，7］。氯胺酮可促进动物和人类大脑神经元的死亡，氯胺酮诱导的神经毒性的关键机制是引发神经元凋亡、坏死［3，8-10］。miRNA 可通过调控基因表达来参与细胞的生理病理过程，以及多种疾病的发生［4，11］。研究发现miR-223 在过氧化氢处理的海马神经元表达下调，右美托咪定可通过促进miR-223 表达来抑制过氧化氢诱导的神经毒性作用［3］。miR-223-3p 过表达的间充质干细胞的外泌体可改善脑缺血大鼠学习与记忆能力，抑制炎症反应及神经功能损伤［12］。miR-223 过表达可通过抑制NLRP3 炎性体来保护氧化低密度脂蛋白刺激的人血管内皮细胞免于细胞焦亡［13］。本研究发现miR-223 过表达可降低氯胺酮诱导发育期大鼠潜伏期、海马组织病理学程度、神经元凋亡、IL-18、IL-1β，增加穿越平台次数、第三象限停留时间占比，该结果表明，

miR-223 过表达可改善氯胺酮诱导的发育期大鼠的认知能力及海马组织神经元损伤，抑制炎症反应，从而起到神经保护作用。

氯胺酮已被发现可通过激活Caspase-1 依赖性细胞焦亡来诱导海马细胞凋亡［14］。NLRP3 可被某些危险信号激活，通过募集Caspase-1 并与其形成炎性小体使其活化，诱导GSDMD裂解，形成细胞焦亡标志GSDMD-N，破坏细胞膜，使IL-18 及IL-1β分泌到细胞外，造成细胞焦亡和炎症反应，抑制NLRP3∕Caspase-1 激活可抑制细胞焦亡［15］。研究发现，电针治疗可以通过促进miR-223 表达来抑制NLRP3 水平，从而减轻神经炎症，在大鼠动脉闭塞中起到神经保护作用［16］。miR-223 高表达可通过抑制NLRP3-Caspase-1 信号通路的激活来提高热性惊厥大鼠学习记忆能力，同时抑制海马神经元的损伤［5，17］。本研究发现，miR-223 过表达可降低NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-N 表达水平，和前人研究结果相似［15］，除此之外抑制该通路激活可进一步加强miR-223 过表达对氯胺酮诱导的发育期大鼠海马神经元焦亡的改善。该结果表明，miR-223 过表达可有效抑制氯胺酮诱导的发育期大鼠海马神经元焦亡，并且，其发挥的神经保护作用可能与其抑制NLRP3∕Caspase-1通路有关。

综上所述，miR-223 过表达可能通过抑制NLRP3∕Caspase-1 通路来减轻氯胺酮诱导的发育期大鼠海马神经元焦亡，从而起到神经保护作用。本研究不仅为氯胺酮诱导海马神经损伤的治疗提供有效的治疗靶点，还对其发生机制研究具有重要意义。但本研究未对miR-223在其他通路中的调控作用进行探究，因此这为下一步的研究提供了方向。