PM2.5暴露通过NF-κB信号通路致雄性大鼠生殖功能障碍

邱娴娴 安妮妮 江克华 彭金普 赵银银 孙发，

1贵州医科大学（贵阳 550004）；2贵州医科大学附属人民医院（贵阳 550002）

全世界男性不育症发病率的上升引起了世界卫生组织的关注。导致男性生殖功能障碍的原因包括环境因素和生活方式等［1］。近年来，随着社会工业化的发展，空气污染变得更为严重，雾霾天气对男性生殖系统的影响一直是研究的重点［2-3］。雾霾的成分中，细颗粒物PM2.5 粒径小，黏附力强，易携带多种重金属及化学物质，所以与其他颗粒物相比，它造成的危害更大。然而，目前的研究主要集中在PM2.5 对呼吸及心血管系统的影响上［4-7］。随着男性不育率的升高，PM2.5 对男性生殖功能造成的不利影响成为亟需解决的问题。已有研究表明，PM2.5 可通过氧化应激、IRE 1∕JNK∕自噬信号通路等影响精子发生及睾丸正常功能［8-9］。然而，炎症损伤也是导致男性生殖功能障碍的核心因素之一。WANG 等［10］就指出PM2.5 暴露可通过炎症造成生殖损害。尽管如此，目前关于炎性损伤的研究探讨仍较少，其机制有待于进一步阐明。为此，本研究通过建立PM2.5 暴露雄性SD 大鼠生殖损伤模型，探讨PM2.5 暴露后致大鼠生殖功能障碍的可能机制，为临床上改善男性生殖功能、降低不育率提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取30只健康雄性SD大鼠，8周龄（约300 ～400 g），由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供（合格证号：No.430726210100140623）。在12 h 光照∕黑暗动物房中，温度（22 ± 2）℃，相对湿度65% ～75 %下适应性喂养1 周后开始实施实验。

1.2 实验试剂及材料 PM2.5 由贵阳市疾病预防控制中心提供。超声震荡仪（KQ250 江苏昆山舒美公司）；真空冷冻干燥机（Gene Company Limited基因有限公司）；电子分析天平秤（湘仪天平仪器设备有限公司）；EP 管（武汉塞维尔生物科技有限公司）；一抗GAPDH Mouse（abcam 公司）；二抗HRP-Goat anti Rabbit；HRP-Goat anti Mouse（KPL 公司）；RNA 提取液（Servicebio 公司）；三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司）；异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（HyClone 公司）；Servicebio®RT First Strand cDNA Synthesis Kit（Servicebio 公司）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）（Servicebio 公司）；引物（Servicebio 公司）；75%乙醇由HyPureTMMolecular Biology Grade Water 配制；乙醚（贵州医科大学设备科提供）；水合氯醛（武汉塞维尔生物科技有限公司）；睾丸组织固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司）；离心机（Gene Company Limited 基因有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 PM2.5 混悬液制备 将样本玻璃纤维滤膜剪成1 cm×1 cm 小片，置于适量双蒸水中，使用超声震荡仪震荡4 次，每次30 min。震荡完成后得到PM2.5 混悬液，再经八层无菌纱布滤过。将滤出的液体置于贵州省人民医院中心实验室真空冷冻干燥机中进行干燥24 ～48 h，得到PM2.5 固体粉末，置于-80 ℃冰箱内储存。使用前用电子分析天平秤称取适量PM2.5 粉末，置于EP 管中，用无菌生理盐水 分别 配 成 浓 度 为4.3 mg∕mL 及12.8 mg∕mL 的PM2.5 混悬液，配置后于实验室紫外线杀菌后再次用超声震荡仪混匀后使用。

1.3.2 PM2.5 染毒模型制备 将30 只雄性SD 大鼠随机分为三组，每组10 只，分笼饲养，分别命名为生理盐水对照组、PM2.5 低浓度（PM 4.3 mg∕mL）暴露组、PM2.5 高浓度（PM 12.9 mg∕mL）暴露组。将SD 大鼠置入密闭容器内经乙醚吸入麻醉后，低浓度组组和高浓度组使用气管插管气管内滴注法给予PM2.5 混悬液（剂量：1 mL∕kg），每隔2 天滴注1 次；对照组用同样方法按给予无菌生理盐水（剂量：1 mL∕kg），总持续暴露时间为4 周。实验中对大鼠精神、饮食、皮毛及死亡情况进行记录。

1.3.3 大鼠睾丸脏器系数计算 所有大鼠经PM2.5暴露4 周后，禁食8 h 用水合氯醛腹腔注射麻醉动物致安乐死，称取大鼠的最终重量并记录。立即解剖取大鼠睾丸组织称重，然后放入-80 ℃冰箱内储存待使用。按下列公式计算脏器比重：脏器系数（%）=脏器质量（g）∕体质量（g）×100%。

1.3.4 睾丸组织HE染色病理观察 仔细分离大鼠睾丸，将睾丸用动物睾丸组织固定液固定，24 h 后用乙醇脱水，行石蜡包埋。然后将组织切成5 μm切片，固定在切片上，去石蜡，再水化，用苏木精和伊红染色（HE 染色）。在光学显微镜下对睾丸组织进行200 倍和400 倍放大。

1.3.5 测定血清性激素睾酮（T）含量 解剖时立即取约5 mL 腹主动脉血，用离心机经3 044 g 离心15 min 后，将血清仔细吸出置于EP 管内，保存在-20 ℃冰箱中待用。将大鼠血清标本送至贵州省人民医院检验科用吖啶酯化学发光免疫检测法检测血清T 含量。

1.3.6 实时定量PCR 法检测大鼠睾丸组织中TNF-α、IL-6 和IL-1βmRNA 表达水平 根据引物设计原则，参照SD 大鼠TNF-α、IL-6 和IL-1β 基因文库，依据文献及软件同源检索后合成相应引物序列，见表1。从-80 ℃冰箱中取出大鼠睾丸组织，使用Trizol 法提取睾丸组织RNA，然后利用紫外分光光度计检测提取的样品RNA 浓度和含量，同时配置逆转录反应液，将RNA 逆转录合成c-DNA，随后配置PCR 反应体系液，在设置好的反应条件下根据引物序列进行实时荧光定量PCR 反应（表1）。用熔融曲线法评价mRNA 扩增特异性，利用软件工具根据2-ΔΔCT方法计算各基因的相对表达量。

表1 引物序列表Tab.1 The table of primersequences

1.3.7 WB法检测大鼠睾丸组织中IKK和NF-κB、p-NF-κB p65、p-IκB-α 蛋白的表达 在冰块上将约50 mg 睾丸组织放入匀浆器中，加入裂解液反复匀浆，直至样本完全碾碎后倒入干净EP 管中以20 392 g 离心20 min，收集上清液保存于-80 ℃冰箱中待用。采用BCA 法测定蛋白质浓度。然后行蛋白电泳、转膜，加入一抗及二抗完成免疫反应，重复三次测定蛋白表达。内参照为GAPDH。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件分析数据，对所有数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布时以均数±标准差表示。多组间比较采用ANOVA 单因素方差分析，两独立样本采用t检验，方差不齐时采用Tamhane's T2 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠睾丸重量及睾丸系数 PM2.5 暴露4 周后，称取大鼠体重及睾丸重量，并计算睾丸系数。与对照组比较，实验组大鼠睾丸重量减低；三组大鼠睾丸系数差异无统计学意义，见表2。

表2 三组大鼠睾丸重量及睾丸系数Tab.2 Testicular weight and testicular index of rats in the three groups ±s

表2 三组大鼠睾丸重量及睾丸系数Tab.2 Testicular weight and testicular index of rats in the three groups ±s

组别对照组低浓度组高浓度组睾丸重量（g）1.90±0.14 1.69±0.18 1.77±0.19睾丸系数（%）0.48±0.02 0.42±0.08 0.41±0.04

2.2 大鼠睾丸组织HE 染色观察 PM2.5 暴露后，与对照组相比，实验组大鼠睾丸组织曲细精管管壁变薄，各级生精细胞排列松散紊乱，管腔中成熟精子数量减少（图1B-C）。高倍镜下，高浓度组睾丸组织曲细精管管壁基底膜断裂，生精细胞脱落至管腔中（图1E-F）。

图1 PM2.5 暴露后睾丸组织HE 染色形态学改变Fig.1 The morphological changes of testis tissue through HE staining after PM2.5 exposed

2.3 大鼠血清睾酮（T）含量 将三组大鼠腹主动脉血离心后的血清用吖啶酯化学发光免疫检测法检测性激素T，实验组血清T 含量较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 PM2.5 暴露后三组大鼠血清T 含量Fig.2 The content of serum T in the three groups after PM2.5 exposed

2.4 各组大鼠睾丸组织中TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 水平比较 用实时荧光PCR 法检测大鼠睾丸组织中TNF-α、IL-6 和IL-1βmRNA 表达水平。与对照组相比，实验组睾丸组织中TNF-α、IL-6 mRNA 表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。低浓度组和高浓度组中IL-1β mRNA 表达较对照组稍增高，但差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 各组大鼠睾丸组织中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA 表达水平Fig.3 The mRNA expression level of TNF-α、IL-6 and IL-1β in rat testist Issue in each group

2.5 各组IKK 和NF-κB、p-NF-κB p65、p-IκB-α蛋白表达 PM2.5 暴露4 周后留取睾丸组织采用WB 法检测相关蛋白表达情况及结果显示：实验组睾丸组织中IKK、NF-κB、p-NF-κB p65 和p-IκB-α蛋白表达明显上调，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且高浓度组IKK 和p-NF-κB p65 蛋白显著高于低浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 各组大鼠睾丸组织中IKK、NF-κB、p-NF-κB p65 和p-IκB-α 蛋白表达水平和灰度值比较Fig.4 The protein expression level and the gray value comparisonofIKK、NF-κB、p-NF-κB p65 and p-IκB-α in rat testis tissue in each group

3 讨论

PM2.5 是人群中普遍存在的一种污染物，它对全世界人类健康造成了威胁［11］。在全球不同国家及地区，暴露于空气污染物PM2.5 导致了过早的死亡率，也增加了严重疾病的发病率［12］。且已有不少研究证实PM2.5 对男性生殖功能造成不同程度的损害。JUREWICZ 等［13］指出以细颗粒物PM为主的大气污染物可能导致男性精子DNA 的断裂、精子运动减低，从而降低男性生育力。因此，开展高PM2.5 暴露水平的研究对于居住在PM2.5 污染严重地区的居民来说是有意义的。结合贵阳市大气污染特点，开展露天暴露或短期内收集PM2.5难以达到本次研究目的，因此本研究请本市疾控中心专业人员收集贵阳市一整年大气中PM2.5，制备成PM2.5 混悬液进行实验。本研究通过气管滴注法建立雄性SD 大鼠生殖损伤模型，使用的气管滴注法及PM2.5 浓度、滴注剂量都是根据前人的研究确定制备的［14-15］。

生殖功能的损害作用反映在睾丸重量和组织结构的变化上。本研究结果显示实验组大鼠睾丸重量较对照组减轻，光镜下观察实验组生精细胞结构疏松，成熟精子数量减少，曲细精管管壁变薄，生精细胞脱落至管腔中，说明PM2.5 对大鼠生殖功能造成了损害。YANG 等［9］在探讨PM2.5 对雄性大鼠的损害中也发现PM2.5 暴露后，光镜下睾丸生精细胞结构破坏，精子数量减少。精子数量减少及成熟障碍是男性生殖系统损伤的标志之一。同样，ZHANG［14］和WEI 等［16］用气管滴注法将不同浓度PM 滴注于大鼠体内，结果发现大鼠精子活力下降，精子畸形率增加。这些结论在一定程度上加强了本研究中PM2.5 对男性生殖系统的损伤的证据。

睾酮是由睾丸间质细胞分泌的一种主要男性性激素，同雌激素属于类固醇类激素，对男性性发育及第二性征的维持起着重要作用。有研究指出，血清睾酮降低可能是睾丸间质细胞损伤的一个重要标志［17］。本研究结果表明暴露于PM2.5 后大鼠血清睾酮的含量显著减低，反映出PM2.5 可能损伤了大鼠睾丸间质细胞，导致其内分泌功能障碍，睾酮含量减低。

男性生殖道炎症对精子的产生具有危害作用。LI 等［18］通过构建类似真实环境的独特PM 吸入系统，发现PM2.5 暴露后大鼠睾丸组织生精管和生精总量明显减少，并阐明与睾丸组织中特异性炎性因子TNF-α、IL-6 等上调致靶器官受损有关。本研究中，PCR 法结果证实实验组睾丸组织中TNF-αmRNA 及IL-6mRNA 表达显著高于对照组，但IL-1βmRNA 升高差异不明显，说明PM2.5 暴露后，大鼠睾丸组织内可能发生了炎性反应，进而促进大量炎性因子的产生，造成炎性损伤。PM2.5 对男性睾丸炎性损伤的具体信号通路尚未完全阐明。在炎性反应中，核转录因子NF-κB（nuclear transcription factor）信号通路是近20年来的研究热点。NF-κB 是一条经典的炎症信号通路，对于免疫系统的发育和维持、炎症反应的控制以及先天和适应性免疫至关重要［19-20］。其家族由NFκB1、NFκB2、RERA、REL 和RELB 编码的5 个成员组成，分别为p50、p52、p65（Rela）、c-rel 和relB［21］。在细胞未受到刺激时这5 个成员以同系或异二聚体的形式存在于细胞质中，并与IκB 结合［22］。当受内外源性刺激后在IKK（IκB 激酶）的介导下促使IκB-α 发生磷酸化，磷酸化后的IκB-α继续发生泛素化，并被蛋白酶降解，使原先存在于细胞质中的NF-κB 二聚体游离进入细胞核，调节核内基因转录，进而诱导各种炎性因子的过表达，进一步激活NF-κB 通路，从而放大炎症级联［23-24］。研究发现，PM2.5 可激活NF-κB 炎症信号通路，且磷酸化的p65（p-NF-κB p65）及IκB-α（p-IκB-α）蛋白为NF-κB通路活化的标记物［25］。本研究中，实验组IKK、NF-κB、p-NF-κB p65 和p-IκB-α 蛋白表达均显著上调，表明了在本研究中NF-κB 炎症信号通路可能被激活，激活后产生大量的IL-6、TNF-α和IL-1β 等炎性因子，放大炎症级联，造成睾丸组织的炎性损伤。本的研究结果强烈提示雄性大鼠生殖功能的损害可能是通过NF-κB 炎症信号通路激活引起的睾丸炎症损伤。

综上所述，PM2.5 可能通过诱导NF-κB 炎症信号通路，上调IL-6、TNF-α 和IL-6 的表达，从而导致雄性大鼠生殖功能障碍。目前，关于炎症与PM2.5所致男性生殖功能损害关系的研究较少，其具体相关蛋白及信号通路尚未完全阐明，本研究的具体机制仍需进一步确认和研究。