奥沙利铂通过自噬诱导胃癌细胞耐药的机制

聂微 严芝强 成兴真 刘丽荣 杨芳，3

1贵州医科大学医学检验学院临床检验基础与血液学教研室（贵阳550004）；贵州医科大学附属医院2胃肠外科，3临床检验中心（贵阳 550004）

铂类药物研发于20 世纪60年代，是美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推荐的胃癌一线基础化疗药，其中OXA 属于第三代铂类抗肿瘤药物，OXA 进入细胞后可以和细胞质中线粒体和细胞核上的DNA 结合、形成多种交链结构，抑制肿瘤细胞DNA 的复制和转录［1］。铂类引起的线粒体和细胞核上DNA损伤可以激活多种信号转导途径、进而激活细胞凋亡信号，当信号转导途径被异常激活或抑制时，细胞会表现出对铂类药物的抵抗及凋亡抑制［2］。OXA 的胃肠道反应、肾毒性及血液毒性低于第一、二代铂类药，临床患者通过OXA 联合治疗后可获得近50%的缓解率，还可提高患者5年生存率及生存质量［3］；但随着用药时间的延长，OXA 耐药严重影响了患者治疗效果。为此，如何提高胃癌细胞对OXA 的敏感性、避免化疗耐药性的产生，是目前亟待解决的临床问题，研究耐药机制并探索可能的逆转耐药策略是解决问题的关键，而建立良好的耐药细胞株模型是进行体外研究肿瘤细胞发生耐药机制的前提。

自噬是机体的稳态机制，生理情况下细胞的基础自噬水平较低，通过细胞内溶酶体降解细胞产生的无用成分，包括错误折叠的蛋白质、毒性聚合物和受损的细胞器等，从而维持细胞的存活，发挥细胞的质检及自净作用［4］，当自噬过程发生紊乱，这种自稳调控机制就会失灵，细胞的稳态受到破坏，发生细胞死亡和组织损伤，导致多种疾病的发生［5-6］。有研究表明，化疗药物可在肿瘤细胞中诱导自噬的发生，为细胞适应环境存活而提供条件［7-8］，有证据表明自噬和耐药密切相关［9］，自噬诱导肿瘤细胞耐药的机制可能有两种：一方面肿瘤细胞可以利用溶酶体消化降解细胞内功能障碍的细胞器、蛋白及各种生物大分子，并通过回收利用，使细胞免于凋亡或死亡，为细胞的生存提供重要保障；另外，自噬是通过某种方式缓解细胞内部的压力，同时降解有害物质，使细胞能适应新环境，保证细胞内环境稳定及生存［10］。

OXA 是胃癌患者一线基础化疗药，长期用药会导致耐药的产生，其机制与化疗药物诱导肿瘤细胞的自噬功能异常有关。本研究选取人胃癌细胞MGC-803 构建OXA 耐药细胞株MGC-803∕OXA，用倒置显微镜观察细胞的形态学变化，检测细胞耐药指数；用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡，RT-qPCR 检测耐药相关基因多药耐药基因1（mμltidrug resistance gene1，MDR-1）、多药耐药相关蛋白（mμltidrug resisetance-related proteins，MRP）、切除修复交叉互补基因（excision repair cross complementing 1，ERCC1）的mRNA 表达，Western blot检测耐药相关基因蛋白MDR-1、MRP、ERCC1 及自噬相关蛋白P62、Beclin-1 和LC3 表达；同时用透射电镜观察MGC-803∕OXA 细胞中自噬体数量及结构变化；探讨OXA 治疗胃癌时的耐药机制，为逆转耐药策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物及细胞株 人胃癌细胞株MGC-803（Cat.No.TC-hxbz-026，深圳拓普生物技术有限公司），奥沙利铂（Oxaliplatin，OXA，恒瑞制药公司），3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，上海Selleck公司）。

1.1.2 实验试剂与仪器 细胞活力检测试剂盒（CCK8，日本同仁化学研究所），GAPDH 抗体（武汉三鹰proteintech），MRP、MDR-1、ERCC1、P62、Beclin-1 和LC3 抗体（美国CST），Trizol 试剂、RT Mix、SYBR EX Taq（Takara 公司），RIPA 细胞裂解液（上海碧云天生物技术公司），蛋白浓度检测试剂盒（杭州弗德生物科技有限公司），ECL 试剂盒（Millipore），倒置相差显微镜（Olympus 公司），罗氏480 PCR 仪（Roche 公司），透射电镜（日本JEOL）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 所有细胞在37 ℃饱和湿度的5% CO2培养箱中培养，培养液为10%胎牛血清（FBS，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和1%链霉素的1640 培养基。

1.2.2 人胃癌耐药细胞株的诱导 采用OXA 浓度梯度递增诱导法诱导MGC-803 细胞获得耐药，起始的OXA 浓度为0.1 μg∕mL，加药孵箱24 ～48 h 后根据细胞生长状态更换无OXA 的培养基，培养过程中密切观察细胞的生长状态，合适时进行传代，重新复苏待细胞生长至对数生长期并生长状态良好时再次换成含有OXA 的培养基，并逐渐提高OXA 浓度，视细胞生长状态逐步增加OXA 的递增量，浓度梯度如下：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μg∕mL，前期细胞生长较缓慢，当细胞生长接近正常时，逐渐加大OXA 浓度，加至4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg∕mL；增加药物浓度后，细胞生长开始变慢，当浓度加到32.0 μg∕mL 时，开始出现很多死细胞，再连续培养3 个月，发现细胞能在4 μg∕mL 的OXA 浓度中稳定生长的耐药细胞株，并用MGC-803∕OXA 表示。用倒置相差显微镜下观察细胞形态，分别取生长状态良好的MGC-803∕OXA 及MGC-803 进行下一步实验。耐药细胞模型于实验前1 周撤去含OXA 的培养基进行培养，并且传代稳定生长后使用。

1.2.3 CCK-8 法检测MGC-803/OXA、MGC-803细胞的耐药性 取计数好的、混匀的细胞悬液，按照104∕孔接种于96 孔板中，每孔200 μL，5% CO2、37 ℃孵箱中培养24 h，室温无菌PBS 洗3 次后，加入OXA 处理，去除原含药物培养基，再次用室温无菌PBS 洗3 次后，向96 孔板中加入100 μL 去血清1640 培养基；避光条件下向各孔中加入CCK8试剂10 μL，37 ℃培养箱孵育2 h。酶标仪上测定各孔在450 nm 处的吸收光值（即OD值），一般的OD值在0.5 ～2.5，若在0.8 ～1.5 时则表示结果较为准确。同时设置1640 对照组、阴性对照组及实验组。细胞抑制率=（对照孔-实验孔）∕（对照组-空白组）×100%，根据计算的细胞抑制率绘制细胞生长曲线。抑制率=［1-实验组A 值∕对照组A 值均值］×100%，50%抑制浓度（IC50）计算耐药系数（RI）=IC50耐药细胞∕IC50亲代细胞。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取出生长至80%的MGC-803∕OXA、MGC-803 细胞，预冷PBS 1.5 mL洗细胞2 ～3 次收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS 1.5 mL 洗涤，去除PBS 和细胞碎片，再加入500 μL 预冷PBS，边震荡边加入70%酒精，酒精至少3.5 mL，4 ℃固定4 h 以上。固定好的细胞于-20 ℃保存。1 000 r∕min 离心5 min 后去掉乙醇，加入PBS 再次洗涤后去上清，将残存的乙醇除去，加入PBS 200 μL、RNA 酶2 μL，室温下30 min消化RNA。加入50 μg∕mL PI 染料0.5 mL，室温避光30 min，将细胞过滤至含PBS 的离心管中，1 h 内用流式细胞仪检测，一般计数2 ～3 万个细胞。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取出长至80%的MGC-803∕OXA、MGC-803 细胞，预冷PBS 洗细胞2 ～3 次收集细胞沉淀，加入1 mL 预冷PBS 转移至1.5 mL 离心管。每管加入1×Binding Buffer 100 μL混均匀，每管各加FITC 5 μL、PI 5 μL，室温避光反应15 min，1 500 r∕min 离心5 min（4 ℃），在1 h 内流式细胞仪检测，一般计数2 ～3 万个细胞。

1.2.6 TRIzol法提取总RNA MGC-803∕OXA、MGC-803 细胞在培养瓶中长满80%，取1 ～5 × 105个细胞用PBS 洗涤细胞2 次。加入1 mL TRIzol 剧烈震荡，使用氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA，加DEPC 水40～80 μL 溶解，于-80 ℃冰箱保存。在酶标仪上测定RNAOD260∕OD280比值，比值在1.8～2.0纯度符合要求。验证合格的RNA 用RT Mix 逆转录为cDNA。

1.2.7 Real time PCR检测mRNA的表达变化 引物序列设计：GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 基因引物序列均由上海生工生物工程技术服务公司合成，序列如表1。测定mRNA 的相对表达量时使用GAPDH 作为内参。反应体系为20 μL，扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 个循环。结果采用2-ΔΔCt法分析各基因mRNA 的相对表达量。

表1 GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 基因引物序列Tab.1 GAPDH、MRP、MRP-1、ERCC1 gene primer sequence

1.2.8 Western blot 蛋白印迹分析检测蛋白水平的变化 6 孔板每孔细胞加80 μL 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min 提取总蛋白并使用蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，每孔上样蛋白总质量为30 μg，进行SDS-PAGE 电泳，转膜封闭后使用特异性一抗孵育16 h 以上，TBST 缓冲液清洗3 次后使用二抗孵育1 h，使用ECL 发光试剂盒通过印迹曝光仪进行图像获取，再使用image J 分析软件测定蛋白条带的积分光密度值，每个样品同时检测GAPDH 蛋白条带作为内参。

1.2.9 透射电子显微镜（TEM） MGC-803∕OXA、MGC-803 细胞在培养瓶中长满80%时倒掉培养液，加入电镜固定液，4 ℃固定2 ～4 h，细胞低速离心至管底可以看到绿豆大小的细胞团块，1%琼脂糖包裹，0.1 mol∕L 磷酸缓冲液（pH7.4）漂洗3 次，每次15 min。1%的锇酸0.1 mol∕L 磷酸缓冲液PB（pH7.4）室温（20 ℃）固定2 h。0.1 mmol∕L 磷酸缓冲液PB（pH7.4）漂洗3 次。依次加入50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精，100%丙酮，上行脱水。丙酮∶812 包埋剂=1∶1 浸泡2 ～4 h，丙酮∶812 包埋剂=2∶1 渗透过夜，纯812 包埋剂5 ～8 h，将纯812 包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37 ℃烤箱过夜。60 ℃烤箱聚合48 h。超薄切片机切片厚60 ～80 nm。铀铅双染色（2%醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15 min），切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.2.10 用自噬抑制剂3-MA 药物诱导细胞 细胞密度生长至70%，使用终浓度为5 mol∕L 的3-MA处理24 h，对照组加入同等体积的DMSO 处理相同的时间。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据统计分析，采用Graphpad Prism 8.0 作图，计量资料符合正态分布，用均数±标准差表示，方差齐性检验方差齐时，单因素分析采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药细胞的诱导和细胞生物学特性

2.1.1 细胞形态 倒置相差显微镜下可见MGC-803和MGC-803∕OXA 细胞形态学特点：MGC-803 细胞贴壁生长、呈上皮样单层排列、大小较均一、细胞形态规则、边界清晰、核大、圆形或椭圆形；MGC-803∕OXA 耐药细胞同样呈上皮样单层排列，但细胞体积增大，形态不规则、边界欠清晰、核大、色深、折光性变强、并常呈聚团生长状态，细胞增殖缓慢，死亡细胞较多。见图1。

图1 MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞的形态Fig.1 Morphology of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.2 MGC-803 和MGC-803/OXA 的耐药指数 MGC-803 和MGC-803∕OXA 耐药指数测定：OXA 浓度梯度为0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg∕mL，CCK8 法检测细胞OD值计算细胞抑制率，以药物浓度为横轴，细胞抑制率为纵轴，绘制浓度效应曲线，求得半数抑制浓度（IC50），计算MGC-803∕OXA 耐药指数为7.04（RI= IC50（耐药株）∕IC50（亲本株）），RI ＞5认为耐药细胞系的耐药性符合耐药株的要求。见图2。

图2 MGC-803、MGC-803∕OXA 对OXA 药物的IC50Fig.2 IC50 diagram of MGC-803 and MGC-803∕OXA to Oxaliplatin

2.1.3 MGC-803 和MGC-803/OXA 的细 胞 周期分布 流式细胞仪检测细胞周期分布，结果发现OXA 诱导后MGC-803∕OXA 耐药细胞株对数生长期的增殖速度减慢，G0∕G1 期分布增加、S 期分布明显减少、G2∕M 期分布明显延长，与MGC-803 比较差异具有统计学意义（P＜0.05），提示OXA 可改变耐药细胞的细胞周期。见图3。

图3 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的细胞周期分布Fig.3 Cell cycle distribution of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.4 MGC-803 和MGC-803/OXA 的细胞凋 亡 结果 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，OXA 诱导后MGC-803∕OXA 的凋亡明显减少，与MGC-803比较差异具有统计学意义（P＜0.05），提示OXA 抑制耐药细胞凋亡。见图4。

图4 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的细胞凋亡Fig.4 Apoptosis map of MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.1.5 耐药相关基因MDR-1、MRP、ERCC1 mRNA在MGC-803 和MGC-803/OXA 中的表达 RTqPCR 检测耐药相关基因mRNA 表达水平，结果显示MGC-803∕OXA 的细胞中MDR-1、MRP、ERCC1 mRNA 表达高于MGC-803（P＜0.01）。见图5。

图5 MGC-803、MGC-803∕OXA 细胞耐药相关基因mRNA表达Fig.5 mRNA expression of drug resistance related genes in MGC-803 and MGC-803∕OXA cells

2.1.6 耐药相关基因MDR-1、MRP、ERCC1蛋白在MGC-803和MGC-803/OXA细胞中表达 Western blot 检测耐药相关基因蛋白表达，结果显示MGC-803∕OXA 的细胞中MDR-1、MRP、ERCC1 蛋白表达高于MGC-803（P＜0.05）。见图6。

图6 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的细胞中耐药相关基因蛋白表达Fig.6 Protein expression of drug resistance-related genes in MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.2 MGC-803 和MGC-803/OXA 细胞中P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达 Western blot 检测MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞中P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ∕Ⅰ等自噬相关蛋白的表达，结果显示与亲本细胞株MGC-803 相比，MGC-803∕OXA 中P62 蛋白表达下调，Beclin-1 蛋白的表达和LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白比值均显著增加（P＜0.05），提示耐药细胞中的细胞自噬被激活。见图7。

图7 MGC-803 和MGC-803∕OXA 的细胞中P62、Beclin-1 和LC3 的蛋白表达Fig.7 Protein expression of p62、Beclin-1 and LC3 in MGC-803 and MGC-803∕OXA

2.3 MGC-803 和MGC-803/OXA 细胞中自噬小体数量及结构 透射电镜观察MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞中的超微结构，结果显示与MGC-803相比，耐药细胞株MGC-803∕OXA 细胞内具有典型的、内含胞浆成分的空泡状双层膜样结构的自噬体，且数量显著增加，提示耐药细胞株的自噬被激活。见图8。

图8 MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞自噬小体（A 和B×1.5 k，C 和D×6.0k）Fig.8 Levels of autophagy vesicles in MGC-803 and MGC-803∕OXA（A&B×1.5 k，C&D×6.0k）

2.4 自噬抑制剂3-MA 对MGC-803 和MGC-803/OXA 自噬水平的影响 5 mmol∕L 的3-MA 分别作用MGC-803 和MGC-803∕OXA 24 h 后，Western blot方法检测P62、Beclin-1 和LC3Ⅱ∕Ⅰ蛋白的表达。结果提示，MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞在3-MA作用24 h 之后，细胞中P62蛋白表达升高，Beclin-1蛋白表达和LC3Ⅱ∕Ⅰ比值下降（P＜0.05），提示3-MA 可以抑制MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞的自噬水平。见图9。

图9 自噬抑制剂3-MA 对MGC-803 和MGC-803∕OXA 细胞自噬的影响Fig.9 Effect of autophagy inhibitor 3MA on autophagy of MGC-803 and MGC-803∕OXA

3 讨论

胃癌是消化系统最常见的肿瘤之一，主要治疗手段是手术治疗结合放化疗及靶向治疗［11］，虽然目前新型化疗药和靶向药物的开发提高了胃癌患者治疗效果，延长了生存期［12-13］，但中晚期胃癌5年生存率仍然徘徊在27%左右［14］。药物抵抗已成为限制晚期胃癌患者绝对生存时间的主要瓶颈。

耐药机制一直尚未完全清楚，体外建立肿瘤耐药细胞株是研究肿瘤细胞产生耐药机制的重要手段，也是耐药机制研究的实验基础，所以运用药物刺激建立耐药株使得探索其机制成为了可能。本研究采用OXA 浓度梯度递增诱导法，间歇药物诱导MGC-803 使其获得耐药，起始的OXA 浓度为0.1 μg∕mL，通过逐步快速递增培养液中OXA 浓度，对MGC-803 进行体外诱导和筛选，大约6 个月获得了最终可在4 μg∕mL 的OXA 浓度中稳定生长的耐药细胞株MGC-803∕OXA，其耐药性是亲本株的7.04 倍，且在脱离OXA 培养1 个月以及将细胞冻存3月后再复苏发现其仍能较好生长并增殖，耐药性基本保持稳定（RI = 7.0），按此标准划分建立的细胞株为中度耐药［15］。在倒置显微镜观察发现，相较于亲本细胞MGC-803，耐药细胞MGC-803∕OXA 形态发生明显改变，大小不均一，形态不规则，边界欠清晰，细胞体积增大，核大、色深，不规则，折光性变强，细胞增殖缓慢，死亡细胞较多。从细胞周期分布可以看出，经过OXA 诱导后MGC-803∕OXA 耐药细胞株对数生长期的增殖速度明显减慢，MGC-803∕OXA 的G0∕G1 期分布略有增加，S期分布明显减少，G2∕M 期分布明显延长，提示MGC-803 细胞经OXA 诱导作用后，其细胞周期分布发生改变，主要表现为G2∕M 期延长。这与徐宗斌等［16］建立的耐药细胞株结果相似。从细胞凋亡结果可以看出，MGC-803∕OXA 细胞凋亡细胞数分布明显少于MGC-803，这与任静等［17］所建立的耐药细胞株结果相似，说明MGC-803 耐药细胞株的凋亡明显受到抑制，细胞凋亡通路受到抑制也是肿瘤细胞耐药的一个重要因素。MDR-1、MRP、ERCC1 基因异常表达与肿瘤的耐药性产生关系较为密切。本研究检测出MGC-803∕OXA 细胞中MDR-1、MRP、ERCC1mRNA 和蛋白表达较MGC-803 显著升高，说明MGC-803∕OXA 细胞耐药的产生，从而证明MGC-803∕OXA 细胞株为耐药细胞株。

近年来越来越多的研究表明，化疗可在肿瘤细胞中诱导自噬的发生［8，18］，自噬是机体的稳态机制，细胞的基础自噬水平较低，通过溶酶体降解细胞内成分，包括错误折叠的蛋白质、毒性聚合物和受损的细胞器等，从而维持细胞的存活［4-5］。当营养匮乏、氧化应激及化疗等都可诱导细胞内自噬的发生，从而为细胞适应环境存活而提供条件。相关报道提示自噬和肿瘤细胞的化疗耐药相关，诱导自噬可导致肝癌和肺癌对顺铂产生耐药［18］。而胃癌细胞在多种因素的作用下通过诱导自噬的发生促进癌细胞的生存［19］。因此，本研究首先需要明确胃癌的OXA 耐药细胞株（MGC-803∕OXA）细胞的自噬水平。

自噬是一个动态过程，一般包括自噬泡（phagophore）产生、自噬体（autophagosome）形成、自噬体融合（fusion）及自噬体降解（degeneration）四个阶段，自噬过程中自噬相关基因（autophagy-related gene，atg）及微管相关蛋白-3（LC-3）起到重要作用，Beclin1 是酵母菌Atg6 蛋白的哺乳细胞同源蛋白，是自噬发生过程中的核心蛋白，可作为评价自噬水平的指标。LC3 是酵母菌Atg8 蛋白的哺乳动物同系物，在自噬小体双层膜结构的形成及自噬泡修饰中起到重要作用，其羧基端被Atg4 迅速剪切，产生定位于胞浆的LC3-Ⅰ。在自噬体形成过程中，LC3-Ⅰ通过泛素样反应，结合到PE 上，产生脂质化的LC3-Ⅱ，并定位到自噬体的膜上，是自噬体的重要标志物，随自噬体膜的增多而增加。本研究釆用了多种方法检测胃癌耐药细胞株MGC-803∕OXA 和亲本细胞MGC-803 的自噬水平。首先，通过免疫印迹的方法发现，MGC-803∕OXA 中自噬相关蛋白P62 蛋白表达低于MGC-803 亲本细胞，Beclin 1 表达和LC3Ⅱ∕Ⅰ的比值高于MGC-803 亲本细胞。说明耐药细胞株自噬被激活，自噬小体增多，而P62 蛋白表达减少，自噬体与溶酶体正常融合，自噬流正常。接着，通过透射电镜观察细胞的超微结构，更为直观观察到耐药株MGC-803∕OXA 细胞比MGC-803 亲本细胞具有更多典型的自噬体及溶酶体结构。以上结果表明OXA 耐药的胃癌耐药细胞株MGC-803∕OXA 和MGC-803 亲本细胞均发生了自噬。为了进一步验证自噬可以调控胃癌细胞对OXA 的耐药性，本研究利用自噬抑制剂3MA 分别作用两组细胞后，MGC-803∕OXA 和MGC-803 细胞自噬相关蛋白P62 蛋白表达量上调，而Beclin-1 的蛋白表达和LC3Ⅱ∕Ⅰ的比值均下调，自噬水平明显受到抑制。本研究还发现自噬抑制剂处理后，耐药细胞株中MGC-803∕OXA 自噬水平下调比亲本细胞更为显著。这提示3MA 抑制了OXA 对自噬的激活作用，表明OXA 诱导的自噬，有利于维持耐药细胞的存活，是胃癌细胞耐受OXA 的机制之一。

本研究成功构建耐OXA 胃癌细胞株并探讨了OXA 治疗胃癌时的耐药机制，为临床寻找提高耐药细胞对OXA 敏感性的方法以及寻找OXA 耐药细胞高效低毒的耐药逆转剂提供实验基础。下一步可以此为实验基础，通过细胞实验和动物实验进一步探讨调控胃癌细胞耐药的分子标志物和治疗靶点。