线粒体相关细胞凋亡诱导因子3通过调控STAT3信号通路影响结直肠癌细胞增殖与迁移

梁炜杰 张耀伟 王永佳 翁佳雯 郑奕琳 丁轶

南方医科大学南方医院放疗科（广州 510515）

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。2020年全球结直肠癌新发病例为193.16万，死亡病例为93.52 万，分别位于所有恶性肿瘤的第三位和第二位［1］。新增病例多发生于西方国家。然而在我国，结直肠癌发病人数也呈现逐年增加的趋势，2020年中国癌症数据显示结直肠癌的发病率和病死率分别位居我国第二位和第五位，严重威胁着人民的健康［2］。因此，提高结直肠癌的治疗有效率成为了一个迫切的问题。为了实现结直肠癌的早期诊断和精准治疗，必须全面了解结直肠癌发生发展中的分子机制。虽然结直肠癌的发生发展是一个复杂多级的过程，但其实有迹可循，从正常肠组织发展到腺瘤再发展为癌组织，其中涉及到基因突变的累积，内环境的变化以及多条信号通路的异常激活或者抑制［3-5］。通过了解结直肠癌的分子机制，可以寻找适合的生物靶点，开发对应靶向药物。在结直肠癌的生长过程中，会发生细胞的代谢重编程，为其旺盛的增殖速度与细胞迁移行为提供充足的能量，而这一过程的中枢则是线粒体［6-7］。线粒体掌控着肿瘤细胞的能量和代谢，而线粒体相关蛋白往往在肿瘤的增殖、迁移、凋亡等过程发挥着重要作用［8-9］。

线粒体相关细胞凋亡诱导因子3（apoptosis inducing factor mitochondria associated 3，AIFM3）是线粒体中依赖Caspase 凋亡途径的关键因子，可介导细胞色素C 从线粒体释放入胞质［10］。既往研究发现AIFM3 参与了肝细胞癌的增殖和凋亡过程［11］，但AIFM3 与结直肠癌的发生发展是否存在关联，目前国内外还鲜有报道。通过前期研究以及数据分析，笔者发现AIFM3 在结直肠癌中表达异常，同时与患者预后存在相关性。本研究拟分析AIFM3 的表达与结直肠癌组织类型和预后的关系，以及观察AIFM3 对结直肠癌细胞增殖和迁移等行为的影响，探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 测序数据 生物信息学分析所用的测序数据和临床数据来源于The Cancer Genome Atlas（TCGA）数 据 库（https：∕∕portal.gdc.cancer.gov∕）和GENE EXPRESSION OMNIBUS（GEO）数据库（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕geo∕）。

1.1.2 细胞与组织 结肠癌细胞系HCT116和SW620均购自（American Type Culture Collection）ATCC 细胞库，由我系液氮冻存。沉默AIFM3基因的慢病毒及其相应的对照载体购于吉凯公司（上海，中国）。shRNA 序列如下：shAIFM3：5'-CCAAGACTCTGAGCTGCAA-3'。转染后，利用嘌呤霉素（Sigma，美国）进行筛选获得稳定细胞株。收集南方医院2017-2019年17 例结直肠癌患者石蜡标本，每一例标本均包含癌组织与正常肠黏膜组织（即距离癌组织10 cm 以外的正常肠黏膜组织）。

1.1.3 试剂与仪器 CCK-8 试剂来自日本同仁公司，Falcon Transwell 小室来自美国BD 公司。qRTPCR 检测所用引物是利用Primerbank 网页和NCBI网页设计，由锐博生物公司代为合成。引物序列如下：AIFM3-F：5'-CCAGGAGGGAAAGCTGAAGG-3'；AIFM3-R：5'-CCTGGGACATTGGTCTGCAT-3'；GAPDH-F：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；GAPDH-R：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；TRIzol、RNA 逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒均来自TAKARA 公司。全蛋白提取试剂盒来自南京凯基生物有限公司。GAPDH、β-actin 抗体购自Abcam 公司；AIFM3、STAT3、p-STAT3、JAK1、JAK2抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 所有细胞均用含有10%胎牛血清、100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 链霉素的DMEM 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。利用Lipo2000，将重组慢病毒干扰载体及其对照载体转染进HCT116 及SW620 细胞，48 h 后利用荧光显微镜观察转染效率，再使用1 μg∕mL 的嘌呤霉素筛选，获得稳定传染细胞株。利用Western blot法检测细胞AIFM3 蛋白的敲低效率。实验分为干扰组和阴性对照组两组，干扰组：转染沉默AIFM3的慢病毒的HCT116∕SW620 细胞；阴性对照组：转染对照载体的HCT116∕SW620 细胞。

1.2.2 免疫组化实验 按照免疫组化步骤，分别将肿瘤组织及癌旁对照孵育相应抗体，并以DAB显色。选取5 个高倍视野进行结果评估，分别计数细胞的着色强弱（无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分）及阳性细胞百分率为阳性细胞数占总细胞数的比例（1 分：0%～25%，2 分：26%～50%，3 分：51%～75%，4 分：＞75%），两者相乘的结果为该片评分结果：0 分为阴性，1～4 分为弱阳性，5～8 分为阳性，9～12 分为强阳性。

1.2.3 qRT-PCR 法检测细胞中的基因表达 取对数生长期细胞进行胰酶消化，离心后收集细胞，用TRIzol 从结直肠癌细胞系中提取总RNA，cDNA 逆转录试剂盒逆转录成cDNA，Nanodrop 2000 光谱仪（Thermo Fisher Scientific）测定DNA浓度。qRT-PCR用1 μg cDNA 与SYBR Green 试剂，应用Biosystem 7500qPCR 系统（Applied Biosystems）进行扩增。以GAPDH 为内参基因，用2-ΔΔCT方法比较相对表达。

1.2.4 CCK8 法检测细胞增殖能力 收集细胞，以200 个∕孔的浓度接种到96 孔板，每组5 个复孔，培养24、48、72、96、120 h 后加入100 μL 5 mg∕mL CCK8 溶液，37 ℃孵育2 h 后，检测450 nm 波长下吸光度（OD）值。

1.2.5 平板克隆法检测细胞增殖能力 收集细胞，以500 个∕孔的浓度接种到6 孔板，每组3 个复孔，培养2 周后取出倒掉培养基，利用PBS 清洗3 遍，多聚甲醛固定20 min，1%结晶紫染色15 min，PBS再度清洗后置于显微镜下观察，选4 个高倍视野进行细胞计数，取平均值。

1.2.6 Transwell 法检测细胞迁移能力 收集细胞，用无血清培养基稀释后以50 000 个∕孔接种于Transwell上室，每孔200 μL，下室加入600 μL DMEM完全培养基，培养36 h 后取出上室，甲醇固定20 min，擦掉上室残余细胞，1%结晶紫染色15 min，PBS 清洗后置于显微镜下观察，选取4 个高倍视野进行细胞计数，取平均值。

1.2.7 Gene set enrichment analysis（GSEA）通路富集分析 从通路数据库网站MsigDB（https：∕∕www.gsea-msigdb.org∕gsea∕msigdb∕）下 载7.0 版 的HALLMARK 注释基 因 集，并 将TCGA 中的567 份结直肠癌样品的按AIFM3 的中位表达量分为高表达组和低表达组，利用R 包“clusterProfiler”进行GSEA 分析［12］。富集结果筛选标准为P＜0.05 和假阳性率FDR ＜0.25。

1.2.8 Western blot 法检测细胞相关蛋白表达情况 收集细胞提取蛋白，测定蛋白浓度，在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）上分离蛋白质，然后将其转移到硝酸纤维素膜上。在4 ℃过夜孵育一抗，次日于室温下孵育1 h 二抗，进行化学发光显影。

1.3 统计学方法 应用GarphPad Prism8.0 和R 语言进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；免疫组化结果和测序数据组间比较采取wliconx 秩和检验；采用Kapalan-Meier 曲线和Log-rank 检验方法比较AIFM3 高表达组和低表达组的生存差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AIFM3 在结直肠癌中的差异表达 为了研究AIFM3 在结直肠癌中的表达情况，分析四个结直肠癌的测序数据集：TCGA、GSE117606、GSE100179、GSE71187，比较数据集提供的肿瘤组织和癌旁组织的RNA 测序数据，发现在结直肠癌组织中AIFM3 表达量显著低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05，图1A）。同时利用在南方医院病理科保存的17 对配对的肿瘤组织和癌旁组织，进行免疫组化染色并且评分，发现AIFM3 在癌旁组织的表达量明显高于肿瘤组织（P＜0.05，图1B）。分析AIFM3 表达量与结直肠癌预后的关系发现：无论是总生存率OS 还是无病生存率DFS，AIFM3 高表达组都显著高于低表达组（P＜0.05，图2）。

图1 结直肠癌组织和癌旁组织中AIFM3 的差异表达Fig.1 Differential expression of AIFM3 in colorectal cancer and adjacent tissues

图2 AIFM3 的表达量与结直肠癌患者预后情况的联系Fig.2 Relationship between the expression of AIFM3 and the prognosis of patients with colorectal cancer

2.2 AIFM3 基因表达沉默的HCT116/SW620 细胞系的鉴定 提取8 种结肠癌细胞系的RNA，通过逆转录及qRT-PCR，选择表达量最高的细胞系SW620 和另一株表达量处于中间水平的HCT116进行后续的功能实验（图3A）。建立稳定干扰AIFM3 表达的细胞株HCT116∕SW620 后，采用qRTPCR 方法和Western blot 方法进行鉴定，结果显示，转染重组载体后，HCT116∕SW620 细胞中AIFM3 的蛋白表达水平明显低于HCT116∕SW620-NC 细胞（图3B、3C），说明AIFM3 基因表达沉默的HCT116∕SW620 细胞系构建成功。

图3 AIFM3 基因表达沉默细胞系的构建Fig.3 Construction of AIFM3 gene expression silencing cell line

2.3 CCK8 法结果分析 从第2 天起，敲低AIFM3后，HCT116 细胞和SW620 细胞增殖速度显著增加，从第4 天开始，两组之间的差异有统计学意义（P＜0.05，图4A）。

2.4 细胞迁移实验结果分析 Transwell 迁移实验也表明随着AIFM3 的表达降低，其迁移能力明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05，图4B）。

2.5 平板克隆结果分析 敲低AIFM3 后，HCT116细胞和SW620 细胞形成克隆团的数量显著增多（P＜0.05，图4C）。

图4 AIFM3 的敲低促进了结直肠癌细胞的增殖与迁移Fig.4 Knockdown of AIFM3 promotes the proliferation and migration of colorectal cancer cells

2.6 通路富集结果分析 经过对GSEA 的富集结果进行筛选，发现与AIFM3 关系密切的信号通路有10 条，包括血管生成、移植排斥反应、干扰素反应、STAT3 信号通路等（图5A）。基于现有文献，JAK∕STAT3 信号通路的激活与结直肠癌细胞增殖、迁移等行为关系密切［13］。且STAT3 蛋白本身存在于细胞线粒体内，参与调控电子传递链的活性，影响着线粒体呼吸和细胞代谢过程［14-15］。GSEA 分析结果还显示IL6∕JAK∕STAT3 信号通路基因集富集于AIFM3 低表达组（图5B）。相关性分析则提示AIFM3 与STAT3 信号通路中的关键分子STAT3 的RNA 表达量呈负相关（r=-0.15，P＜0.001，图5C）。

2.7 Western blot 实验结果分析 Western blot 结果显示敲低在肿瘤细胞中敲低AIFM3 后，STAT3信号通路中的关键分子STAT3 蛋白以及磷酸化状态的STAT3 蛋白的表达显著增加，提示该通路被激活（图5D）。而STAT3 上游蛋白JAK1，JAK2 蛋白的表达则无显著变化。

图5 敲低AIFM3 激活了STAT3 信号通路Fig.5 Knocking down AIFM3 activates the STAT3 signaling pathway

3 讨论

结直肠癌（CRC）是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一。而且近年来，中国的CRC 发病率的持续上升，发病人群也趋向于年轻化［2］。其中，CRC 的转移依然是导致患者死亡的主要原因，而肿瘤转移是一个步骤繁多的复杂过程，其中局部迁移是肿瘤细胞进入血液循环的前提。目前，CRC 的迁移机制尚未明确，现有的抗转移治疗主要针对已形成转移的病灶，但对于如何预防肿瘤的早期迁移与播散尚无有效策略。因此，深入了解CRC 的增殖、迁移侵袭等关键步骤的分子机制，可为CRC 的转移提供更有效的防治策略。

线粒体蛋白在多种癌症的致癌作用中起着关键作用，其表达水平与癌症的发生发展密切相关［8-9，16］。AIFM 蛋白家族是一种线粒体内部的氧化还原酶，参与线粒体内呼吸链的组装以及调控细胞的生长与凋亡［17］。该蛋白家族包括了三个蛋白结构相似的成员AIFM1、AIFM2 和AIFM3，其在肿瘤相关研究中也屡有报道。AIFM1 在肝癌与宫颈癌中能通过诱导凋亡抑制肿瘤细胞生长［18］。AIFM2 则在肺癌中参与了化疗药物诱导的细胞凋亡过程［19］，而且近年来被报道参与了多种肿瘤的铁死亡过程［20-21］。目前关于AIFM3 在肿瘤中的研究较少。有研究表明AIFM3 在肝癌中作为miR-210 的直接靶点，参与肝癌细胞的细胞周期调控。在缺氧环境中，miR-210 通过下调AIFM3 来抑制肝癌细胞的凋亡［11］。此外也有研究表明AIFM3 与乳腺癌、胆管癌的进展相关［22-23］，但缺乏细胞实验的验证以及机制上的探索。而迄今为止，关于AIFM3在结直肠癌中的作用鲜有报道。因此，探索AIFM3的作用和机制对于全面了解结直肠癌的发生发展的过程具有重要意义。

本研究通过生物信息学和临床样品的免疫组化分析，发现AIFM3 在结直肠癌组织中的表达明显低于邻近正常组织。通过慢病毒转染的方式在两种人源性结直肠癌的细胞株中敲低目的蛋白AIFM3，探索其对细胞功能的影响，结果表明AIFM3 的敲低显著增强了结直肠癌细胞的增殖与迁移能力。在机制上，通过GSEA 算法以及MisgDb数据库中提供的HALLMARK 通路相关基因集分析，发现AIFM3 与STAT3 信号通路关联密切。STAT3 信号通路是一条在肿瘤生长过程中发挥重要作用的经典信号通路，介导着肿瘤的增殖、侵袭、分化、迁移等过程［13］，与本研究细胞表型实验结果相符合。STAT3 蛋白通常被认为穿梭于细胞质与细胞核之间，作为转录因子介导相关核基因表达。但也有研究表明STAT3 蛋白广泛存在于线粒体膜间隙、内膜和基质中，与AIFM3 定位重合，参与调控氧化还原呼吸过程中的电子链传递（ETC），发挥着细胞呼吸调节剂的作用［14-15］。因此，笔者认为AIFM3 在结直肠癌细胞中的作用与STAT3 信号通路存在关联。相关性分析则提示AIFM3 的RNA 表达量与STAT3 呈现负相关关系。而进一步的WB 实验验证了AIFM3 的敲低会上调STAT3 与磷酸化状态的STAT3 的蛋白表达量，证明AIFM3 在结直肠癌细胞株中被敲低以后，通过激活STAT3 信号通路，促进了结直肠癌细胞的增殖和迁移。而STAT3 的两个经典上游分子JAK1和JAK2 的蛋白表达量则未观察到明显变化，笔者猜测它们与AIFM3 和STAT3 在线粒体内的作用无直接关联。

与癌旁组织相比，AIFM3 在结直肠癌组织中被显著下调，其下调可能是结直肠癌发生发展的重要原因之一。本研究还利用TCGA 以及来自于GEO 数据库的三个不同的结直肠癌临床数据集探索了AIFM3 表达量与预后的关系。这四个数据集的结果一致表明，AIFM3 表达量较高的患者拥有更为良好的总生存率（OS）与无病生存率（DFS），提示AIFM3 作为预后标志物的潜在价值。

综上所述，本研究探索了AIFM3 在结直肠癌中的作用与机制，证实了AIFM3 在结直肠癌中表达下调，而细胞功能实验提示敲低AIFM3 可通过激活STAT3 信号通路进而促进肿瘤细胞的增殖与迁移。此外，AIFM3 的表达与结直肠癌患者的预后存在关联。这些结果表明AIFM3 有望成为结直肠癌的分子治疗靶点，以及可作为判断患者预后情况的指标。