LncRNA MAGI2-AS3调控miR-374b-5p∕HOXB7信号通路对脓毒症相关脑损伤的影响

黄巍 张庆祥 罗丹 冯彰凤

桂林市人民医院重症医学科（广西桂林 541002）

脓毒症脑病（sepsis encephalopathy，SE）是脓毒症一种严重的并发症，患者表现出不同程度的认知功能障碍［1-2］。目前认为，SE 引起的认知障碍与海马神经发生功能障碍有关［3］。脑神经发生功能障碍已被证明受长非编码RNA（lncRNA）的调控［4］。因此，基于lncRNA 的治疗可能对SE 诱导的神经变性有效。lncRNA MAGI2-AS3 已被确定为多种疾病中细胞活力的调节剂［5］。最近研究报道了MAGI2-AS3 过表达通过下调miR-374b-5p 可以增强Aβ25-35 对神经元活力和神经炎症的影响，并且MAGI2-AS3 敲低可以减轻神经毒性和神经炎症［6］。这些结果提示MAGI2-AS3 与miR-374b-5p相互作用可能参与神经疾病进展。因此，本研究将探究MAGI2-AS3 与miR-374b-5p 是否参与小鼠模型中脓毒症诱导的海马神经元凋亡和认知功能障碍，并进一步分析敲低MAGI2-AS3 和上调miR-374b-5p 是否可以改善这些脓毒症诱导的影响。

1 材料与方法

1.1 动物来源和分组 将成年雄性C57BL∕6 J小鼠（6 ～8 周龄，25～31 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司）。实验中仅使用雄性小鼠，以尽量减少因脑病病理学的性别差异而导致的异质性。将小鼠随机分为6 组：假手术组（sham）、CLP 组、CLP+si-NC 组，CLP+si-MAGI2-AS3、CLP+NC mimic和CLP+miR-374b-5p，每组15只。CLP组：使用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）手术建立小鼠脓毒症模型；CLP+si-MAGI2-AS3 组：在CLP 术之前3 d 注射针对MAGI2-AS3 的短干扰RNA；CLP+miR-374b-5p 组：CLP 术前3 d 注射miR-374b-5p 模拟物；CLP+si-NC 组：CLP 术前3 d 注射乱序对照siRNA；CLP+NC mimic 组：CLP 术前3 d注射模拟物对照。在CLP 手术后，小鼠从第8 天开始进行5 d 的Morris 水迷宫试验，并在第13 天进行恐惧条件反射测试。然后处死小鼠，取出海马组织。

1.2 CLP模型建立 使用腹膜内氯胺酮（80 mg∕kg）和甲苯噻嗪（5 mg∕kg）麻醉动物。消毒后，在剑突下方纵向做一个2 ～3 cm 的切口以暴露腹腔［7］。分离盲肠并在极远端与盲肠基部之间距离的一半处结扎，用22 号针头穿刺两次。将粪便内容物轻轻挤压到腹腔中。然后，将盲肠小心地放回腹腔，并缝合腹部。对于假手术组的动物，打开腹腔以暴露盲肠，无需结扎或穿孔。手术后，腹腔内给予1 mL 预热至37 ℃的无菌生理盐水进行补液。

1.3 基因敲低和过表达 MAGI2-AS3 敲低和miR-374b-5p 过表达使用具有以下序列的siRNA 敲低MAGI2-AS3：5'-CAGCAGAGAAATGATATCTAGACCA-3'（si-MAGI2-AS3）和乱序对照序列：5'-GACCGATAACGAAAGCACAAATTGT-3'（si-NC）。siRNA、miR-374b-5p mimic（miR-374b-5p）和NC 慢病毒载体（NC mimic）由上海吉玛制药技术有限公司设计和合成。使用EntransterTM 体内转染试剂（北京英格恩生物有限公司）转染慢病毒，将2.5 μg 慢病毒溶解在2.5 μL 无RNase 的水中，然后与2.5 μL体内转染试剂轻轻混合，并在室温下保持15 min。CLP小鼠用0.5%戊巴比妥钠（50 mg∕kg，腹腔注射）麻醉，头部固定在SR-5 立体定向框架（日本Narishige公司）。硬脑膜暴露后，在无菌条件下用微量注射器（瑞典Dakumar Machinery 公司）将5 μL 混合物注射进脑室内。立体坐标是左半球前囟的外侧1.0 mm 和后0.5 mm，硬脑膜表面下方2.5 mm。注射后将注射器保持在原位10 min，以尽量减少液体回流。

1.4 Morris 水迷宫测试 由对分组不知情的研究人员进行标准的5 d Morris 水迷宫测试。在最初的4 d 小鼠接受空间获取训练，每天进行4 次，每次间隔为20 min。每次训练的时间为60 s。训练动物通过游泳到原始目标象限水面下0.5 cm 处的隐藏平台上逃脱。未能在60 s 内定位平台的动物被人工引导至平台。在移出之前，允许小鼠在平台上停留20 s。使用运动检测软件（美国Actimetrics instruments 公司）分析逃逸潜伏期。第5 天，平台被移除以进行探针测试。在60 s 的测试中，记录目标象限上的交叉次数和在该象限中花费的总时间。

1.5 恐惧条件反射测试 在Morris 水迷宫实验完成后的第2 天进行了恐惧条件反射测试。所有小鼠都被放置在一个用70%乙醇擦拭过的带有不锈钢条地板的室中。该腔室允许声音刺激以训练条件反射，以及使用恒流发生器对脚进行电刺激。允许小鼠在训练环境中探索和适应3 min。然后，采用单频声音刺激30 s（1 kHz，80 dB），并在该声音结束的最后2 s 期间，传递足部电击（1 mA）。在30 s 的停顿之后，再次应用这种声音刺激和足部电击的组合。24 h 后，允许小鼠在没有任何刺激的情况下进入原始室以监测不动状态行为。2 h后，进行提示恐惧条件反射测试，将动物置于室内并在无足部电击的情况下接受单频声音3 min，并监测和记录不动状态行为。

1.6 标本采集 行为测试后，每组随机抽取5 只小鼠，用0.4%戊巴比妥钠麻醉并固定于解剖板上。通过打开胸部暴露心脏，然后将钝注射器针头通过右心尖插入左心室，用生理盐水完全灌注小鼠，并逐滴补充4%多聚甲醛。脑组织在4%多聚甲醛中固定48 h，然后切成2 ～3 mm 的切片，暴露海马横截面。在常规脱水、透化和石蜡包埋后，将组织切成3 μm 的切片，然后附着在预处理过的载玻片上。另取5 只小鼠颈椎脱臼处死，冰上分离海马组织，液氮处理后-80 ℃保存用于RT-qPCR和Western blot 分析。

1.7 TUNEL 染色 切片采用TUNEL 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）进行染色。苏木精复染，光镜下TUNEL 阳性细胞核呈棕黄色。计数TUNEL 阳性细胞以计算凋亡指数（AI）：AI=阳性细胞数∕细胞总数×100%。

1.8 RT-qPCR 分析 用Trizol RNA 提取试剂盒（美国Thermo Fisher 公司）从各组海马组织中提取总RNA。MAGI2-AS3、miR-374b-5p 和HOXB7 的引物由美国Invitrogen 公司合成。miR-374b-5p 的内参为U6，MAGI2-AS3 和HOXB7 的内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。通过逆转录试剂盒（日本Takara 公司）获得互补DNA。采用实时荧光定量PCR 试剂盒（Takara）进行荧光定量PCR 分析。使用2-ΔΔCT方法将目标基因的相对表达水平归一化为U6 和GAPDH 的相对表达水平。引物序列如下：MAGI2-AS3：Forward：5'-CAAGAAACAGCAACACCAGAAG-3'，Reverse：5'-TAAGGTCCCCATTCAAGTCAGT-3'；miR-374b-5p：Forward：5'-TCGAATCTAGAGATCCGACGCCGC-3'，Reverse：5'-GACGTGTAAACATCCTACACTCAGCT-3'；HOXB7：Forward：5'-TTCATTCCTACCCTCTACCACTTTC-3'，Reverse：5'-TTAACATGGCATCTTCGACACTCT-3'；GAPDH：Forward：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3'，Reverse：5'-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3'；U6：Forward：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'；Reverse：5'-TGATGGCATGGACTGTGGTC-3'。

1.9 Western blot 分析 按照蛋白提取试剂盒（Takara）说明书提取各组海马组织总蛋白，蛋白含量用二辛可宁酸试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）测定。蛋白质通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到聚偏氟乙烯膜上，并在含有5%脱脂牛奶的吐温20 的Tris 缓冲盐水中封闭1 h。随后，将膜与针对HOXB7（1∶1 000）、B 细胞淋巴瘤相关X（Bax）（1∶500）、Cleaved caspase-3（1∶500）（均购自英国Abcam 公司）和β-肌动蛋白（1∶500，美国Cell Signaling Technology 公司）的一抗一起孵育过夜，然后用相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000，Cell Signaling Technology）孵育2 h。在暗处加入增强化学发光溶液进行显色。以βactin 为内参，用Cel-Pro-Analyzer 分析目标条带的灰度值。

1.10 细胞培养、转染和分组 分离新生C57BL∕6 J小鼠海马神经元（24 h 内出生，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司）。通过颈椎脱位对小鼠进行安乐死，去除头部和脑组织上的头骨和皮肤后，取出海马组织并置于预冷的Dulbecco's 改良Eagle培养基中。用木瓜蛋白酶（美国Sigma-Aldrich公司）切割和分离组织。然后将神经元以6 × 105个细胞接种在聚赖氨酸包被的培养皿（35 mm）中，并在含有1% B27（5% CO2、37℃）孵育7 d，每3 天更换一半培养基。细胞分组：空白对照组（未进行任何处理的细胞）；LPS 组（仅用1 μg∕mL LPS 处理细胞24 h）；LPS+si-NC 组（用LPS 处理si-NC 转染的细胞24 h）；LPS+si-MAGI2-AS3 组（用LPS 处理si-MAGI2-AS3 转染的细胞24 h）；LPS+NC mimic 组（用LPS 处理NC mimic 转染的细胞24 h）；LPS+miR-374b-5p 组（用LPS 处理miR-374b-5p 转染的细胞24 h）。转染前48 h，将细胞以3×105个细胞∕mL的密度接种在6 孔板中，并通过Lipofectamine 2000试剂（美国Thermo Fisher 公司）转染慢病毒。

1.11 MTT 测定和流式细胞术 细胞用LPS 处理24 h，用细胞生长液悬浮将细胞浓度调整为1×105个细胞∕mL。将细胞接种到96 孔板中培养48 h（37 ℃，5%CO2），并在最后4 h加入5 mg∕mL MTT 溶液。通过酶标仪检测光密度（OD）值。

细胞用LPS 处理24 h，将细胞用200 μL 结合缓冲液悬浮，与5 μL 碘化丙啶和5 μL Annexin-V在黑暗中均匀混合15 min。流式细胞仪观察细胞凋亡情况，计算各组细胞凋亡率。

1.12 双荧光素酶报告基因检测 使用生物信息学软件DIANA-LncBase v2、Targetscan、miRanda 预测MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 以及miR-374b-5p 和HOXB7 的结合位点。构建含有miR-374b-5p 结合位点的野生型MAGI2-AS3 报告基因（wt-MAGI2-AS3）和HOXB7 报告基因（wt-HOXB7），以及不含结合位点的突变型MAGI2-AS3 报告基因（mut-MAGI2-AS3）和HOXB7 报告基因（mut-HOXB7）。将上述报告基因与miR-374b-5p 模拟物或NC mimic 共转染到海马神经元中。待细胞生长至一定融合度裂解后，用荧光素酶检测试剂盒（美国Promega 公司）检测荧光素酶活性。

1.13 统计学方法 使用SPSS 22.0 分析数据。细胞实验一式三份，测量数据显示为均数±标准差，多组比较行方差分析，使用Tukey 的多重比较检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CLP 小鼠认知障碍评估及MAGI2-AS3、miR-374b-5p 的变化 在Morris 水迷宫中，所有组小鼠的逃避潜伏期在4 d 训练中逐渐降低（图1A）。在第2 ～4 天期间，CLP 组比假手术组有更长的逃避潜伏期（P＜0.05）。CLP 组在目标象限中花费的时间比假手术组更短，并且在目标象限中交叉次数更少（P＜0.05，表1）。在情境式恐惧条件反射测试中，CLP 小鼠的不动状态持续时间比假手术组小鼠短（P＜0.05），而两组在对提示作出反应的不动状态持续时间相似（表1）。在CLP 手术后第3、7 和14 d，与假手术组相比，CLP 小鼠海马组织中MAGI2-AS3 表达逐渐增加（P＜0.05），而miR-374b-5p 表达逐渐降低（P＜0.05，图1B、C）。

图1 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 过表达提高CLP 小鼠的空间学习能力和记忆能力Fig.1 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression enhanced spatial learning and memory in CLP mice

表1 小鼠行为测试Tab.1 Behavioral tests of mice ±s

表1 小鼠行为测试Tab.1 Behavioral tests of mice ±s

注：与Sham 组相比，*P＜0.05，***P＜0.001；与CLP 组相比，#P＜0.05

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2.2 MAGI2-AS3沉默或miR-374b-5p过表达提高CLP 小鼠的空间学习能力和记忆能力 在Morris水迷宫中，转染了si-MAGI2-AS3 或miR-374b-5p 的CLP 小鼠在第2 ～4 天的逃逸潜伏期比CLP 组小鼠缩短（图1A），并延长了在目标象限中的时间使交叉次数增加（P＜0.05，图1B、C）。在情境恐惧条件反射测试中，所有CLP小鼠的不动状态持续时间均比假手术组小鼠短，并且转染了si-MAGI2-AS3 或miR-374b-5p 的CLP 小鼠的不动状态持续时间较CLP 组明显增加（P＜0.05，图1）。各组在对提示作出反应的不动状态持续时间相似（图1）。

2.3 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 过表达减轻CLP 小鼠海马神经元凋亡 与Sham 组相比，CLP 组TUNEL 阳性神经元显著增加（P＜0.05）。与CLP 组相比，si-MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 组中TUNEL 阳性神经元显著减少（P＜0.05，图2A）。与假手术组相比，CLP 组海马组织中Bax 和Cleaved caspase-3 表达增加（均P＜0.05）。与CLP 组相比，si-MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 组 的Bax 和Cleaved caspase-3 表达降低（均P＜0.05，图2B）。

图2 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 过表达减轻CLP 小鼠海马神经元凋亡Fig.2 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression alleviated hippocampal neuronal apoptosis in CLP mice

2.4 MAGI2-AS3 沉 默 或miR-374b-5p 过 表 达 可增强LPS 处理的海马神经元的活力并抑制其凋亡 LPS 处理后，LPS 组神经元增殖抑制率和凋亡率较对照组升高（P＜0.05），并且si-MAGI2-AS3 组和miR-374b-5p 模拟物组神经元增殖抑制率和凋亡率较LPS 组降低（P＜0.05），见表2。

表2 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 过表达可增强LPS处理的海马神经元的活力并抑制其凋亡Tab.2 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression enhanced the viability and inhibited apoptosis of LPS-treated hippocampal neurons ±s

表2 MAGI2-AS3 沉默或miR-374b-5p 过表达可增强LPS处理的海马神经元的活力并抑制其凋亡Tab.2 MAGI2-AS3 silencing or miR-374b-5p overexpression enhanced the viability and inhibited apoptosis of LPS-treated hippocampal neurons ±s

注：与空白对照组相比，**P ＜0.01，***P ＜0.001；与LPS 组相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01

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2.5 MAGI2-AS3 过表达通过miR-374b-5p 上调HOXB7参与神经元损伤 海马神经元与wt-HOXB7和miR-374b-5p 模拟物共转染后，wt-HOXB7 的活性被miR-374b-5p 抑制，细胞相对荧光素酶活性明显降低（P＜0.05，图3A）。此外，海马神经元与wt-MAGI2-AS3 和miR-374b-5p 模拟物共转染后，wt-MAGI2-AS3 的活性被miR-374b-5p 抑制，细胞的相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.05，图3B）。与假手术组相比，CLP 组miR-374b-5p 表达明显下调（P＜0.05），MAGI2-AS3 和HOXB7 表达显著增加（P＜0.05）。与CLP组相比，si-MAGI2-AS3组和miR-374b-5p 组的HOXB7 mRNA 和蛋白表达均显著减少（P＜0.05，图3C、D）。

图3 MAGI2-AS3 通过miR-374b-5p 上调HOXB7 参与神经元损伤Fig.3 MAGI2-AS3 participated in neuronal injury by up-regulating HOXB7 via miR-374b-5p

3 讨论

临床中，与非SE 患者相比，SE 患者长期认知功能障碍的发生率显著增加，并且SE 患者更容易患神经退行性疾病［8-9］。此外，脓毒症模型大鼠脑内神经元数量较对照大鼠减少，神经元形态呈现退行性特征［10］。与先前的研究结果一致，本研究证实了脓毒症导致认知缺陷，并会导致小鼠海马组织中TUNEL阳性神经元明显增多。海马体是大脑中负责记忆形成的关键区域［11］。海马锥体神经元细胞结构的调节会损害突触可塑性和记忆［12-13］。因此，笔者推测脓毒症引起的CLP 小鼠学习和记忆能力下降可能是由海马神经凋亡引起的。

MAGI2-AS3 主要在大脑的突触连接处表达［14-15］。最近研究报道了MAGI2-AS3 过表达可以增强Aβ25-35 对神经元活力和神经炎症的影响，并且MAGI2-AS3 敲低可以减轻神经毒性和神经炎症［6］。此外，还有研究证明MAGI2-AS3调控Fas∕FasL通路抑制神经母细胞瘤生长［16］。本研究中，CLP手术引起的脓毒症导致海马组织中MAGI2-AS3表达增加以及miR-374b-5p 表达降低，抑制MAGI2-AS3∕miR-374b-5p∕HOXB7 信号轴可以保护海马免受脓毒症诱导的海马神经发生缺陷和神经变性。相关研究表明，MAGI2-AS3 在卵巢癌和肝癌组织和细胞系中升高［5，17］，表明MAGI2-AS3 在人类疾病中的促进作用。有研究表明miR-374b-5p 在肝癌或肺癌细胞和组织中的表达降低［5，18］。这些证据表明miR-374b-5p 在人类疾病中具有抑制功能。HOXB7 是一种在DNA 合成转录过程中起关键作用的同源盒基因（HOX）家族中的转录调节因子［19-20］。研究发现HOXB7 在某些癌症中过度表达，例如骨肉瘤和肝癌［21-22］，表明HOXB7 在人类疾病中的刺激作用。本研究证实了MAGI2-AS3 沉默和miR-374b-5p 上调减少了CLP 小鼠海马组织中HOXB7 mRNA 和蛋白表达。因此，MAGI2-AS3 通过靶向miR-374b-5p 上调HOXB7 参与CLP 诱导的神经元损伤。

总之，本研究表明MAGI2-AS3 和HOXB7 在CLP 小鼠海马中上调，而miR-374b-5p 则下调，并且MAGI2-AS3 沉默通过上调miR-374b-5p 和下调HOXB7 来抑制CLP 小鼠海马神经元的凋亡。因此，靶向MAGI2-AS3∕miR-374b-5p∕HOXB7 轴可能为治疗或预防SE 的神经变性提供治疗策略。