新型冠状病毒抗原检测胶体金法与核酸检测实时荧光RT-PCR方法比较

许玉玲 王海霞 李金月 夏向群 黄学勇

河南省疾病预防控制中心，传染病预防控制所，河南省传染病病原生物重点实验室（郑州 450016）

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）（简称新冠肺炎）是近两年全球大流行的一种呼吸道传染病，患者多出现肺部感染症状［1］，给全球经济造成巨大损失。《新型冠状病毒防控方案》（第八版）提出“外防输入、内防反弹”的防控策略，落实“早预防、早发现、早报告、早隔离、早治疗”的措施，严格落实“动态清零”政策。当前新型冠状病毒实验室确诊方法主要为核酸检测实时荧光RT-PCR 法，需要专业实验室、人员和仪器，样本采集后经前处理、提取核酸，PCR 体系配制、PCR 扩增至获得结果，最短需6 h。抗原检测胶体金法检测的是样本中新型冠状病毒的一种蛋白，方便快捷，不受实验条件和仪器限制，采样后10 min 内出结果。本研究选择河南省疾病预防控制中心生物资源库保存的新冠样本，用实时荧光和胶体金两种方法检测，对比结果，分析胶体金法能否作为早期快速诊断新冠感染的一种方法。

1 资料与方法

1.1 标本来源 所有标本来自河南省新冠肺炎监测系统，各省辖市疾控冷链运输至河南省疾病预防控制中心生物资源库，-80 ℃集中保藏。选择2021年7-8月份新冠阳性鼻咽拭子60份，口咽拭子30 份；同期，中高风险区新冠阴性鼻咽拭子60 份，口咽拭子30 份。

1.2 梯度稀释和RNA 提取 所有原始样本按照《新型冠状病毒防控方案》（第八版）》附件10《新冠病毒样本采集和检测技术指南》进行前处理后，在1.5 mL EP管中取原样本50 μL，加450 μL的病毒保存液进行10 倍稀释，混匀后取50 μL，加入450 μL的病毒保存液进行100 倍稀释。原样本、10 倍和100 倍稀释后的样本，使用QIAGEN 核酸提取试剂盒提取核酸。

1.3 RT-PCR 核酸检测 使用武汉明德新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）检测ORF1ab∕N 基因，试剂批号：210804，有效期至2022年6月3日。配制反应体系：反应液20 μL，RNA 5 μL，设阴性、阳性对照，使用ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪，反应条件：50 ℃15 min，1 个循环；95 ℃30 s，1 个循环；95 ℃3 s，60 ℃40 s，40 个循环收集荧光信号。阴性、阳性对照结果正常，Ct值≤38，结果判阳性。

1.4 胶体金法抗原检测 使用南京诺唯赞公司的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒检测，试剂批号V20210506570，有效期至2023年2月17日。将样本80 μL 加入保存液，混匀后加4 滴入检测孔，15 min 内观察质控线和检测线，质控线测出实验成立，观察记录结果。

1.5 统计学方法 使用Excel 和SPSS 25.0 进行统计，计量资料采用（）表示，计数资料采用例数表示。以核酸检测结果为金标准，计算180 个样本胶体金法抗原检测的阳性和阴性符合率，计算13 个阳性样本10 倍和100 倍稀释后，胶体金法抗原检测的阳性符合率。分别对核酸检测目标基因Ct 值＜25 和25 ＜Ct 值＜30 的样本进行分层统计，按照公式分别计算阳性符合率：A∕（A+C）×100%，阴性符合率：D∕（B+D）×100%以及总符合率：（A+D）∕（A+B+C+D）×100%。对胶体金法与核酸检测结果进行Kappa 分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 法核酸检测结果 从大疫情网获得所有样本均采自发病7 d 内，新冠阳性样本90 份，核酸检测目标基因Ct 值均小于35，新冠阴性样本检测结果均阴性。阳性样本核酸检测Ct 值结果见表1。

表1 新冠样本Ct 值结果分布Tab.1 Distribution of Ct values of SARS-CoV-2 samples±s

表1 新冠样本Ct 值结果分布Tab.1 Distribution of Ct values of SARS-CoV-2 samples±s

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2.2 胶体金法抗原检测结果 核酸检测的阳性样本90 个，胶体金法抗原检测只有1 例为阴性，核酸检测阴性样本90 个，金标法抗原检测结果均阴性，见表2。

表2 胶体金标法检测结果Tab.2 Results of colloidal gold method 例

2.3 胶体金法抗原检测与RT-PCR 法核酸检测结果符合率 以核酸检测结果为金标准，胶体金法抗原检测的阳性符合率为98.89%，95%CI：93.97%～99.80%，阴性符合率为100.00%，95%CI：95.91%～100%，总符合率99.44%，95%CI：96.92%～99.90%。对核酸检测目标基因Ct 值＜25，25＜Ct 值＜30 的样本进行分层统计，胶体金法抗原检测的阳性一致率分别为98.44%，95%CI：91.67%～99.72%；98.81%，95%CI：93.56%～99.79%。

2.4 Kappa 分析 Kappa=0.989，胶体金法抗原检测结果与RT-PCR 法核酸检测结果几乎完全一致，一致性好。结果见表3。

表3 抗原检测胶体金法与RT-PCR 法核酸检测结果的Kappa 分析Tab.3 Kappa analysis of colloidal gold method for SARS-CoV-2 and RT-PCR

2.5 梯度稀释后实验结果 13个原样本及其10倍和100 倍稀释后核酸检测ORF1ab 和N 基因分别为：（22.99 ± 3.83）、（22.49 ± 3.96）；（25.74 ± 4.32）、（25.94±4.88）；（28.66±4.16）、（28.85±4.32）。10倍稀释后金标法检测结果均阳性，100 稀释后金标法有2 个阴性，Ct 值均大于33。10 倍和100 倍稀释后金标法阳性符合率分别为100%、84.61%。

3 讨论

《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》，新型冠状病毒肺炎确诊病例需满足新冠疑似病例与核酸检测阳性，或者病毒基因测序与已知新冠病毒高度同源，或未接种过新冠疫苗但新冠特异性IgM 抗体和IgG 抗体阳性等［2］。核酸检测的是新冠病毒的遗传物质RNA，如果检测结果为阳性，可直接确诊为感染病例，检测灵敏度和特异性都高于其他方法。实时荧光RT-PCR 是核酸检测最常用的方法，是确诊新冠肺炎的“金标准”［3］。但PCR 方法也有一些缺点，从前期样本处理到出报告通常需要至少4 ～6 h，且存在一定的假阴性；采样不当、标本保存不当、采用不同类型的标本、采样遇不排毒时期以及使用不同厂家试剂都可能造成核酸检测结果“假阴性”而出现漏诊。

病毒基因测序要求专业仪器、专业人员、测序专用试剂盒，新型冠状病毒基因组全长近30 000 bp，二代测序至少需要48 h 出结果，结果分析更需要专业人员操作。但病毒测序有一锤定音的作用，配合流行病学调查常作为聚集性疫情病毒溯源的终结手段，适用于科研及专业机构。

抗体检测的是患者体内免疫系统应对新冠病毒感染而产生的抗体，新冠患者血清特异性IgM和IgG 抗体在发病1 周内都非常低，随着病程发展，IgM 逐渐升高，在第3 周达到峰值，然后逐渐下降；IgG 抗体在发病后3～6 周上升幅度较大，发病后第9 周达到峰值，并维持一定时间［4］。健康人群全程接种新冠疫苗后，体内特异性IgG 抗体也能维持较长时间。开展全员核酸检测是为发现更多潜在的早期病例，在早期大规模筛查方法中，血清学试验并不适用，在临床上血清学检测结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况动态观察新冠患者的病程［4］，综合判断。

抗原检测胶体金法是检测样本的新型冠状病毒的一种蛋白，采用双抗体夹心法，以固相免疫层析形式进行测定，待检样本的抗原与标记物垫上的抗体结合为胶体金标记抗体-抗原的复合物，继续扩散至T 线（检测线）和C 线（质控线），指示反应完成。如果检测阳性，很可能为新冠感染病例。张赛等［6］研究显示该方法检测新冠病毒抗原灵敏度和特异度都高于96.5%，且与其他呼吸道病原没有交叉反应，可作为现有核酸检测法的补充手段，用作早期筛查。泰国的研究者CHAIMAYO 等［7］对454 份（60 个阳性，394 个阴性）新冠样本进行金标法抗原检测与PCR 检测对比，金标法的灵敏度和特异度为98.33%、98.73%，他们认为这种快速简单的抗原检测金标法可以用作筛查试验。EJAZI 等［8-9］对当前各种新冠诊断方法进行综述，认为核酸检测试剂价格高、检测时间长限制了它在大规模测试中的应用，免疫方法简单且适合大规模检测。国外多个研究团队对比新冠抗原快速检测方法和RT-PCR 检测结果，认为快速检测抗原的方法可以作为RT-PCR 核酸检测的辅助方法［10-12］。本研究180 个样本，核酸检测新冠阳性90 个、新冠阴性90 个。用胶体金法检测抗原，与核酸检测结果比较，胶体金法阳性符合率98.89%，阴性符合率100%。胶体金法抗原检测与RT-PCR法核酸检测方法的一致性统计指标Kappa 值为0.989，一致性非常好。本次研究的新冠阳性样本核酸检测ORF1ab 和N 基因Ct 值为23.00 ± 4.38、21.14 ± 4.20，标本中病毒载量较高，抗原易检出。在金标法未检出的一例鼻咽拭子，分析未检出原因可能与样本曾进行56 ℃30 min 灭活，导致蛋白变性所致。挑选13 个样本进行10 倍和100 倍的稀释，每稀释10 倍，核酸检测靶基因的Ct 数值增加3.24 左右，当Ct 值大于33 时，金标法检测的灵敏度下降，100 倍稀释后金标法灵敏度下降，为84.61%。新冠患者早期感染，咽部排毒量较多，PCR 检测Ct 值较小，胶体金法也更容易检出，患者感染后期和复阳阶段［13］，咽部排毒量逐渐减少，PCR 检测Ct值逐渐增加，Ct 值大于33 后，胶体金法检测容易出现漏检。

抗原检测胶体金法具有较高的敏感度和特异度，该方法快速、简单，准确并且不受场地、仪器、人员限制，可以作为聚集性疫情需要大规模排查时的初筛方法，更早发现新冠感染者，使“早发现”关口前移，提供更多的时间进行摸排、流调及后续一系列防控措施的制定，具有较高的应用价值，可以作为早期辅助诊断新型冠状病毒感染的快速方法。