扁塑藤素增强顺铂对条件性重编程原代肺癌细胞敏感性的机制

石艺 钟燕 刘小虎 柯尊富 陈孝 唐欲博

中山大学附属第一医院1药学部，2病理科（广州 510000）

肺癌是危害人类健康的重大疾病之一。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的83%，肺腺癌是非小细胞肺癌最主要的病理类型［1］。由于肺癌发现时常为晚期，对于这部分患者来说，含铂——尤其是顺铂的联合化疗，是一线推荐的标准治疗方案［2］。然而在治疗中，顺铂耐药性会导致联合化疗方案失败，引起NSCLC 复发和转移并最终致死［3-5］。

NF-E2相关因子（NF-E2-related factor2，NRF2）是调节正常细胞应答反应来抵御外界不良应激刺激的关键转录因子。研究表明，沉默NRF2 表达能下调血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）的表达并增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性［6］。

目前，天然化合物提高化疗敏感性，克服化疗耐药性的策略已被广泛研究［7］。扁塑藤素是一种从卫矛科和翅子藤科植物中提取的醌甲基三萜类化合物，在结肠癌，乳腺癌，肺癌等许多癌种中展现了强大的抗癌活性［8-10］，但其潜在机制还不明确。有研究报道，扁塑藤素能够通过抑制Chk1∕53BP 介导的DNA 损伤修复增敏吉西他滨［11］。

条件性重编程（conditional reprogramming，CR）技术是一种体外培养永生化原代细胞的方法，它无需进行基因操作，简单快速，成功率高，避免了多次传代后性状和基因不可逆丢失。本研究拟以CR 技术培养的患者来源的原代肺癌细胞（conditionally reprogrammed lung cancer cells，CRLCs）为模型，研究扁塑藤素联合顺铂对其增殖、迁移、凋亡的影响，并探讨KEAP1-NRF2∕HO-1 信号通路在扁塑藤素增强顺铂对CRLCs 的抗肿瘤作用的潜在分子机制，以期为肺癌的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器 DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素∕链霉素双抗购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；顺铂购自美国Sigma-Aldrich 公司；Y-27632 购自瑞士Enzo 公司，0.25%胰酶消化液购自上海碧云天生物技术有限公司；KEAP1 兔单克隆抗体、NRF2 兔单克隆抗体、HO-1兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；扁塑藤素购于上海同田生物技术有限公司。CO2细胞培养箱、酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；离心机购自德国Eppendorf 公司；荧光倒置显微镜购自德国Leica 公司。

1.2 细胞和组织来源 Swiss-3T3-J2 细胞购自美国ATCC 公司；共获取中山大学附属第一医院2020年9-11月14例在胸外科接受手术治疗或在呼吸科接受穿刺活检的非转移肺癌患者的肿瘤组织，其中男10 例，女4 例，年龄范围37 ～73 岁，平均年龄59.7 岁。所有组织病理诊断均为肺腺癌。研究已得到中山大学附属第一医院伦理委员会批准和患者及其家属的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 组织处理及CRLCs 培养 剪碎组织块，胶原酶Ⅳ消化液消化组织碎块，37 ℃恒温水浴中震荡解离，过滤去除残留碎块，离心去上清。细胞沉淀按文献［12］操作流程与Swiss-3T3-J2 细胞在含有ROCK 抑制剂Y-27632 的F+Y 培养基于37 ℃，5%CO2条件下共培养。传代和后续操作可用0.05%胰酶消化液去除3T3，再用0.25%胰酶消化液消化CRLCs。

1.3.2 扁塑藤素和顺铂的配制 DMSO 溶解扁塑藤素粉末，制成20 mmol∕L 的PRIS 溶液。生理盐水溶解顺铂粉末，制成5 mmol∕L 的顺铂溶液。药液分装并于-20 ℃避光储存。

1.3.3 MTS 实验检测细胞增殖 以3 000 个∕孔的细胞密度接种CRLCs 于96 孔板上，37 ℃，5%CO2过夜。分别用不同浓度的扁塑藤素、顺铂、Znpp（20 μmol∕L）处理细胞48 h。每孔加入10 μL的MTS工作液，置于37 ℃，5%CO2的培养箱孵育1 h，酶标仪于490 nm 波长处测定OD值，计算细胞活力。细胞活力计算公式：细胞活力（%）=（A实验-A空白）∕（A对照-A空白）×100%。

1.3.4 Calcein-AM/PI 细胞双染实验检测细胞活力 以3 000 个∕孔的细胞密度接种CRLCs 于96 孔板上，37 ℃，5%CO2过夜。扁塑藤素和顺铂分别或联合处理细胞48 h。用含有2 μmol∕L Calcein-AM和1 μg∕mL PI 的PBS 于37 ℃，5%CO2染色30 min。荧光显微镜拍照。

1.3.5 Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力 扁塑藤素和顺铂分别或联合处理细胞24 h，消化细胞，用无血清的DMEM 培养基重悬，以5 × 104个∕孔的细胞密度接种于无或有Matrigel 胶覆盖的Transwell 上室，下室加入含20%FBS 的F+Y 培养基，37 ℃，5%CO2培育24 h（迁移）或48 h（侵袭）。棉签擦去上室细胞，4%PFA 室温固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min，拍照；33%乙酸洗脱，酶标仪于590 nm 波长处测定OD值，计算细胞迁移和侵袭的数量。

1.3.6 Annexin V-APC 流式细胞凋亡术检测细胞凋亡 以20 × 104个∕孔的细胞密度接种CRLCs 于6 孔板上，37 ℃，5%CO2过夜。扁塑藤素和顺铂分别或联合处理细胞24 h。收集细胞，加入500 μL的Binding Buffer 悬浮细胞，加入5 μL 的Annexin V-APC 染液混匀，室温避光反应10 min，流式细胞仪在激发波长633 nm，最大发射波长660 nm 条件下进行检测。

1.3.7 qRT-PCR 检 测mRNA 水 平 用RNeasy Mini Kit（QIAGEN，Hilden，Germany）提取总RNA。用cDNA 反转录试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）对每个样本的总RNA（300 ng）进行反转录。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）通过CFX96TM实时PCR 检测系统完成qRT-PCR 扩增。所有操作基于制造商的说明进行。以GAPDH 为内参将数据归一化处理，用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。

1.3.8 Western blot检测细胞表达水平 用5 mmol∕L ROS 清除剂NAC 或30 μmol∕L NRF2 激活剂tBHQ预处理细胞60 min，再用药物处理细胞24 h；用20 μmol∕L HO-1 抑制剂Znpp 单独或联合药物处理细胞24 h。加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，于冰上摇动裂解30 min，细胞刮刮下细胞，低温高速离心，收集上清，BCA 检测试剂盒对蛋白进行定量，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸变性。蛋白质样品（30 μg）经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后，转移到PVDF 膜上。室温下用5%BSA封闭1 h 后，与一抗在4 ℃下孵育过夜。TBST 洗膜，室温下用HRP 连接二抗孵育1 h，TBST 洗膜，显影仪检测蛋白表达。

1.3.9 ROS 的测定 以4 000 个∕孔的细胞密度接种CRLCs 于96 孔板，37 ℃，5%CO2过夜。5 mmol∕L NAC 预处理细胞60 min 后，扁塑藤素和顺铂分别或联合处理24 h。30 μmol∕L DCFH-DA 避光孵育30 min，倒置荧光显微镜拍照。DCF 的荧光强度用多模式读板仪测定，激发和发射波长为488 nm。

1.3.10 线粒体膜电位的测定 扁塑藤素和顺铂分别或联合处理12 h，5 μmol∕L JC-1 孵育30 min，倒置荧光显微镜拍摄荧光图像。5 mmol∕L NAC 预处理细胞60 min 后，扁塑藤素和顺铂分别或联合处理24 h，收集细胞，用含20 nmol∕L 的DiOC6 的PBS 重悬，37 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪在激发波长482 nm，发射波长504 nm条件下进行检测。

1.4 统计学方法 每个实验至少重复3 次。使用SPSS 25.0 软件进行统计分析，计量资料表示为均值±标准差，比较用单因素方差分析或t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扁塑藤素提高顺铂对CRLCs的细胞毒性 MTS实验结果显示，扁塑藤素和顺铂分别对CRLCs的细胞活力产生抑制且呈剂量依赖性（P＜0.05，图1A、B）。除了1 μmol∕L扁塑藤素和8 μmol∕L顺铂联合组，与单药组相比，扁塑藤素联合顺铂显著抑制了CRLCs 的细胞活力，2 μmol∕L 扁塑藤素和6、8 μmol∕L 顺铂联合组的抑制作用最强（P＜0.01，图1C、D）。Calcein-AM∕PI 双染结果显示，单药组CRLCs 呈Calcein-AM 阳性染色（绿）多而PI 阳性染色（红）少，而扁塑藤素和顺铂联合处理后，细胞呈PI 阳性染色多而Calcein-AM 阳性染色少（图1E）。

图1 扁塑藤素提高顺铂对CRLCs 抗增殖活力和细胞毒性Fig.1 PRIS enhances the anti-proliferative effect and cytotoxicity of cisplatin on CRLCs

2.2 扁塑藤素提高顺铂对CRLCs 的迁移和侵袭抑制作用 Transwell 迁移和侵袭实验结果显示，与单药组相比，扁塑藤素联合顺铂能够显著降低CRLCs 的迁移和侵袭的数量（P＜0.01，图2）。

图2 扁塑藤素增强顺铂对CRLCs 迁移和侵袭抑制的作用Fig.2 PRIS enhances inhibitory effect of cisplatin on migration and invasion of CRLCs

2.3 扁塑藤素提高顺铂对CRLCs 的凋亡诱导作用 Annexin V-APC 流式细胞凋亡结果显示，与单药组相比，扁塑藤素联合顺铂能够明显增加细胞凋亡数（P＜0.01，图3A、B）。Western blot结果显示，相比于单药组，扁塑藤素联合顺铂可显著诱导细胞色素C 释放，增加线粒体凋亡标志物caspase-9、caspase-7、caspase-3 和Bax∕Bcl-2 的表达（P＜0.01，图3C、D）。

图3 扁塑藤素增强顺铂对CRLCs 细胞凋亡的诱导Fig.3 PRIS sensitizes cisplatin-induced apoptosis of CRLCs

2.4 扁塑藤素增加顺铂诱导的CRLCs 内ROS 累积和线粒体功能障碍 ROS 检测结果显示，相比于单药组，扁塑藤素联合顺铂显著增加了ROS 在CRLCs 中的累积（P＜0.01，图4A、C）。线粒体膜电位（MMP）检测结果显示，相比于单药组，扁塑藤素联合顺铂能够显著降低CRLCs 中MMP 的水平（P＜0.01，图4B、E）。 ROS 清除剂NAC 预处理结果表明，NAC 预处理能够削弱扁塑藤素和顺铂诱导的ROS 累积（P＜0.01，图4D），抑制扁塑藤素和顺铂诱导的MMP 降低（P＜0.01，图4F）。

图4 扁塑藤素增强顺铂诱导的CRLCs 内ROS 累积和线粒体功能障碍Fig.4 PRIS enhances cisplatin-induced accumulation of ROS and dysfunction of mitochondria in CRLCs

2.5 扁塑藤素通过抑制KEAP1-NRF2/HO-1 信号通路增强顺铂诱导的细胞凋亡 Western blot 和qRT-PCR 结果显示，相比于对照组和单药组，扁塑藤素联合顺铂显著下调了CRLCs 内KEAP1，NRF2，HO-1的表达以及NRF2，HO-1的mRNA水平（图5AC，P＜0.01）。NRF2 激活剂tBHQ 预处理结果显示，tBHQ 显著提高了NRF2 和HO-1 蛋白表达水平，扁塑藤素联合顺铂能够抑制tBHQ 对NRF2 和HO-1 的激活作用（图5D）。HO-1 抑制剂Znpp 处理后，Western blot 结果显示，Znpp 能够增加扁塑藤素联 合 顺铂上 调 的caspase-3 和Bax∕Bcl-2 表达水 平（图5E、F，P＜0.01）；MTS 实验结果显示，Znpp 能够增强扁塑藤素联合顺铂的细胞活力抑制作用（图5G，P＜0.01）。此外，NAC预处理削弱了扁塑藤素联合顺铂提高的caspase-9，caspase-3，Bax∕Bcl-2表达水平（P＜0.01，图5H、I）。

图5 扁塑藤素联合顺铂对KEAP1-NRF2∕HO-1 信号通路的影响Fig.5 Effects of PRIS and cisplatin on KEAP1-NRF2∕HO-1 signaling pathway

3 讨论

耐药性严重影响了顺铂在肺癌治疗中的应用。天然化合物不仅可以单独产生抗肿瘤作用，还可逆转肿瘤细胞对顺铂产生的耐药作用［7］。利用条件性重编程（CR）技术体外稳定、长期培养原代肺癌细胞，能够保留患者肿瘤的遗传学特性，为肺癌治疗提供药物筛选平台［13］。在前期研究中［14］，笔者应用CR 技术建立了CRLCs，证明了扁塑藤素能通过EphB4∕CDC42∕N-WASP 信号通路诱导线粒体损伤和内质网应激，导致CRLCs 死亡。免疫荧光、免疫细胞化学结果显示，CRLCs 保留了包括CK7、CEA、TTF-1 在内的多种肺腺癌恶性上皮细胞特征；STR 分析表明，细胞培养的早、中、晚期过程中，在9 个表达位点显示一致性。本研究结果进一步显示，扁塑藤素和顺铂分别能以剂量依赖的方式抑制CRLCs 的细胞活力，扁塑藤素能增强顺铂对CRLCs 的抗增殖能力和细胞毒性。此外，扁塑藤素能增强顺铂抑制CRLCs 迁移和侵袭的能力。这与扁塑藤素对肺癌细胞H1299 毒性作用一致［10］。

诱导凋亡是药物发挥抗癌活性的重要途径，涉及细胞色素C、caspase-9、caspase-8、caspase-3、Bcl-2 家族等蛋白的一系列生物学过程［15］。在本研究中，扁塑藤素能增加顺铂诱导的凋亡细胞数量和凋亡相关蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3和Bax∕Bcl-2 的表达。这些结果表明，扁塑藤素能增加顺铂诱导的凋亡作用。

扁塑藤素作用肿瘤细胞会产生过量ROS，诱导线粒体膜通透性上升，表面形成孔洞，进而释放细胞凋亡因子，发生级联反应使细胞死亡［16］。扁塑藤素诱导的过量ROS 也会导致内质网应激，使未折叠蛋白累积超过细胞调节限度，引起细胞死亡［8］。扁塑藤素还能通过ROS 激活ASK1∕JNK 信号通路发挥抗癌作用［17］。本研究结果显示，扁塑藤素联合顺铂能显著增加细胞内ROS 的水平，降低线粒体膜电位，而这些作用可以被ROS 清除剂NAC 阻断。这提示，扁塑藤素联合顺铂能够通过显著抑制氧化应激诱导细胞凋亡。

当细胞处于氧化应激状态时，NRF2 与KEAP1解离，转位进入细胞核，与小Maf 蛋白形成异二聚体，和抗氧化反应元件（ARE）结合，从而调控包括HO-1 在内的多种蛋白的表达［18］。HO-1 是血红素降解的限速酶，与细胞抗炎和抗凋亡作用有关［19］。NRF2 能增加下游HO-1 的表达，抑制血红素和Fbxo22 介导的Bach1 降解，促进肺癌的转移［20］。抑制HO-1 或敲低NRF2 能够增强顺铂对喉部鳞状细胞癌细胞的抗癌作用，增加细胞内ROS 水平和细胞死亡［21］。本研究结果显示，扁塑藤素增强了顺铂诱导的ROS 稳态的破坏，一方面增加了ROS 在细胞中的累积，另一方面又抑制了细胞氧化应激的机制，可能通过调控KEAP1-NRF2∕HO-1 信号通路引起ROS 超载，增强顺铂诱导的细胞凋亡。

本研究结果为扁塑藤素用于顺铂的化疗增敏及发现新的肿瘤耐药∕逆转耐药相关基因提供了实验数据和理论依据。因获取的临床肺癌样本数量有限，故无法对样本根据临床信息进行分组，获取不同亚组间的药物敏感性和分子调控的差异。后续将扩大样本量，按肺癌分子亚型分组、癌细胞分级等因素进行样本匹配后研究，尽量减少因肺癌分子分型等不同而导致的研究结果差异。