茯苓四物汤对造影剂诱导的急性肾损伤模型大鼠肾功能及肾小管上皮细胞凋亡的影响

郭 宁，张胜高，杨文忠，严士海

（1.苏州市中西医结合医院，江苏 苏州 215100；2.江苏省中医院，江苏 南京 210029）

造影剂肾病（contrast induced nephropathy，CIN），是由造影剂引起的急性肾损伤（contrast induced acute kidney injury，CI-AKI），即应用造影剂后新发生的肾功能障碍或者原有肾功能障碍加重，目前机制尚不清楚。CIN一般在使用造影剂后24～48 h发生，目前无特效治疗药物。茯苓四物汤出自清代景日昣的《嵩崖尊生全书》，原方由苍术、茯苓、猪苓、泽泻、官桂、当归、川芎、白芍、生地黄等组成，具有健脾利水、活血养血、祛瘀生新之功效，为治疗尿血经验方。临床报道发现该方在减少蛋白尿、镜下红细胞等方面疗效确切，提示该方可能具有肾保护作用［1-3］。本课题组前期研究发现，茯苓四物汤可降低造影剂相关肾病发生率［4］，为进一步探讨该方在治疗造影剂相关肾病的作用机制，本实验通过建立造影剂诱导的急性肾损伤大鼠模型，观察茯苓四物汤对模型大鼠的肾保护作用，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 选择清洁级雄性SD大鼠40只，体质量（220±20）g。实验大鼠购买于南通大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（苏）2014-0001。予无鸡卵清蛋白饲料喂养，饲养环境温度20～25℃，湿度40%～60%，饲养于江苏省中医院药理实验室。

1.2 药品 吲哚美辛（北京百奥莱博科技有限公司）；左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME，上海萌桠生物科技有限公司）；碘海醇注射液（扬子江药业有限公司，批号19072561，规格350 mg/ml）；茯苓四物汤（组成：苍术9 g、茯苓9 g、猪苓9 g、泽泻9 g、肉桂6 g、当归9 g、川芎9 g、白芍9 g、生地黄9 g，由苏州市中西医结合医院中药房统一煎熬成浓缩汤剂，含生药3.0 g/ml）。

2 方 法

2.1 动物分组 取SD大鼠40只，实验前称重标记后随机分为4组：正常对照组、造影剂肾损伤模型组（以下简称“模型组”）、茯苓四物汤高剂量治疗组（以下简称“高剂量组”）及茯苓四物汤低剂量治疗组（以下简称“低剂量组”），每组10只。

2.2 动物模型建立［5-8］及给药 高、低剂量组及模型组大鼠禁食禁水12 h后，尾静脉注射预先配制的吲哚美辛10 mg/kg，15 min后尾静脉注射左旋硝基精氨酸甲酯10 mg/kg，再15 min后尾静脉注射碘海醇（3 gI/kg体重）。注射碘海醇后血肌酐（Scr）较注射前升高大于25%，提示造模成功。茯苓四物汤低、高剂量组根据药理实验中动物与人体间的等效剂量换算计算出实际应用的给药剂量，灌胃量分别为成人标准体重（60 kg）临床等效剂量的20倍与40倍。低、高剂量组分别于注射碘海醇前3 d、注射碘海醇后2 d每日给予茯苓四物汤（16.95 g/kg、33.9 g/kg）灌胃，灌胃容量为20 ml/kg；正常对照组、模型组予以等量的生理盐水灌胃。各组大鼠均灌胃5 d。

2.3 动物处理 每组于注射造影剂后第48 h麻醉，腹主动脉采血3 ml，以3 000 r/min、4℃离心20 min，采集上清液备检测。采血后在冰上取两侧肾脏，置于冰的磷酸盐缓冲液中，快速去除肾包膜，一侧肾迅速置于10%中性福尔马林中固定，另一侧肾迅速用滤纸吸干水分，置于-80℃冰箱中冰冻保存。

2.4 病理切片及肾小管损伤程度评估 取出的肾脏经10%中性福尔马林固定24 h后，常规石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精进水，苏木素染色，盐酸酒精分化，碳酸锂兰化，伊红染色；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光学显微镜下双盲观察，每张切片于200倍显微镜下随机取10个肾小管间质视野，进行肾小管损伤评分。评分标准［9］：无损伤（-或0分）；轻度（±或1分，单细胞的，片状孤立损伤）；中度（+或2分，损伤≤25%）；重度（++或3分，25%＜损伤≤50%）；极重度（+++或4分，损伤＞50%）。每张切片10个视野评分总和的均值为肾小管损伤评分。

2.5 血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的检测 在OLYMPUS AU2700自动生化仪上检测血清Scr、BUN值。

2.6 TUNEL法检测肾脏细胞凋亡情况 按Dead EndTMColorimetric TUNEL System试剂盒（罗氏公司）说明书进行操作。每只大鼠随机选取5个高倍镜视野，光学显微镜400倍镜下观察，每张切片分别从上、下、左、右、中5个不同视野区分析，计算细胞凋亡指数（AI）=肾小管上皮细胞凋亡细胞数/每个视野肾小管上皮细胞数×100%。

2.7 免疫组化检测Caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3）的水平 肾脏组织标本经石蜡包埋，切片厚3μm，二甲苯脱蜡3次，每次5 min；经下行乙醇水化6次，每次5 min；将切片浸没在枸橼酸钠抗原修复液中，用微波炉加热至沸腾，并保持在95～98℃状态下低沸10 min。将切片静置至室温（25℃），磷酸盐缓冲盐液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次10 min；每片加入临用前稀释成0.3%的H2O2灭活内源性过氧化物酶100μl，孵育15 min；PBS冲洗3次，每次10 min。倒掉液体，每片加入一抗（Abcam，ab2302，USA）100μl（浓度1∶100），阴性对照用PBS代替一抗，湿盒内留少量PBS，盖上湿盒盖；将湿盒放入4℃冰箱过夜（16～24 h），次日晨取出，室温复温30 min；PBS冲洗3次，每次10 min；倒掉液体，每片滴加100μl二抗，将湿盒放入37℃恒温水浴箱内恒温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次10 min。将一滴（30μl）DAB色素浓缩液（Signal Stain DAB chromogen concentrate）加入1 ml的DAB稀释剂中（Signal Stain DAB diluent），混匀，每片加入100～400μl的DAB工作液，显色10 min。乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，拍照。运用CIAS-1000型细胞图像分析仪进行图像分析，400倍视野下观察，每组选取3张切片，每张切片从5个视野分析灰度值，并在空白区分析灰度值，采用光密度做统计分析，光密度（OD）=lg（空白灰度/平均灰度）。

2.8 数据统计 采用SPSS 20.0软件统计分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

3 结果

3.1 对模型大鼠肾脏病理损伤的影响 见表1及图1。模型组大鼠肾小管损伤评分显著高于正常对照组（P＜0.01）；低剂量组、高剂量组评分均显著低于模型组（P＜0.05），且高剂量组较低剂量组评分更低（P＜0.05）。图1显示：正常对照组肾小管正常，上皮细胞完整；模型组病理损伤显著增加，肾小管扩张，管腔内可见大量管型，甚至闭塞；低剂量、高剂量组损伤明显减轻。

表1 各组肾小管损伤评分 （分，±s）

表1 各组肾小管损伤评分 （分，±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05；与低剂量组比较，③P＜0.05

组 别正常对照组模型组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10肾小管损伤评分0.45±0.13 3.17±0.69①2.45±0.53②1.91±0.62②③

图1 各组大鼠肾脏损伤病理图（HE×200）

3.2 对模型大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响 见表2及图2。与正常对照组比较，模型组肾小管上皮细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）；低剂量组、高剂量组大鼠肾上皮细胞凋亡率均明显低于模型组（P＜0.01），且高剂量组较低剂量组肾上皮细胞凋亡率更低（P＜0.01）。图2显示：细胞核呈棕黄色者为阳性细胞，正常对照组肾小管正常，上皮细胞完整；模型组肾小管上皮细胞凋亡显著增加；低剂量、高剂量组肾小管上皮细胞凋亡明显减少。

表2 各组肾小管上皮细胞凋亡率 （±s）

表2 各组肾小管上皮细胞凋亡率 （±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与低剂量组比较，③P＜0.01

组 别正常对照组模型组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10凋亡率（%）4.22±1.35 44.01±5.60①21.85±4.02②10.80±2.60②③

图2 各组肾小管上皮细胞凋亡典型图（TUNEL×400）

3.3 对模型大鼠肾脏Caspase-3表达的影响 见表3及图3。结果显示：模型组Caspase-3光密度值明显高于正常对照组（P＜0.01）；低剂量组、高剂量组光密度值明显低于模型组（P＜0.01），且高剂量组较低剂量组光密度值更低（P＜0.05）。图3显示：Caspase-3主要在肾小管上皮细胞胞浆中表达，部分在胞核中表达，棕黄色颗粒基本均匀分布。正常对照组Caspase-3表达很少，模型组Caspase-3表达显著增加，特别是肾小管上皮区域，低剂量、高剂量组Caspase-3表达显著减少。

表3 各组Caspase-3光密度值比较 （±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与低剂量组比较，③P＜0.05

组 别正常对照组模型组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10光密度值0.55±0.12 2.27±0.27①1.47±0.12②1.05±0.17②③

3.4 对模型大鼠血清Scr、BUN的影响 见表4。与正常对照组比较，模型组Scr、BUN显著增加（P＜0.01）；低剂量、高剂量组Scr、BUN均较模型组显著下降（P＜0.05），且高剂量组下降更显著（P＜0.05）。

表4 各组血清Scr、BUN水平比较 （μmol/L，±s）

表4 各组血清Scr、BUN水平比较 （μmol/L，±s）

注：与正常对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.05；与低剂量组比较，③P＜0.05

组 别正常对照组模型组低剂量组高剂量组n 10 10 10 10 Scr 24.24±3.47 49.34±6.31①32.94±2.98②27.14±4.71②③BUN 8.54±2.19 24.15±4.79①16.01±3.03②12.61±2.38②③

4 讨 论

目前认为CIN主流的发生机制有肾髓质缺氧、氧化应激、肾小管上皮细胞和血管内皮细胞损伤及造影剂的毒性作用等，其危险因素与糖尿病、高血压、心血管疾病、利尿剂使用、高尿酸血症、高龄、造影剂数量及类型等有关［10］。充分水化是有效预防CIN有效的措施［11］，有学者研究发现前列腺素E1、尼可地尔可降低CIN发生率，瑞舒伐他汀可降低慢性肾脏病或糖尿病等高危患者发生CIN的风险［12-14］，但他汀类药物在CIN防治中的作用仍有争议［15］。

中医认为造影剂肾病的主要病因病机为血瘀和毒邪，“毒为先导、毒瘀互结”，病位在肾，标实为主，毒瘀日久、耗伤气血而致虚瘀兼具，且肾为水脏，肾病则水湿痰浊易生，因此泄浊解毒、活血散瘀、化湿行气、调和气血、扶正祛邪是造影剂肾病的主要治法［16-18］。相关研究显示丹红注射液、红花黄色素氯化钠、丹参川芎嗪、丹参多酚酸盐等均具有防治造影剂肾病作用［19］，其可能的肾保护机制为：扩张肾脏血管，改善肾血流灌注，减少肾小球及肾小管内皮细胞损伤；抗氧化、清除氧自由基、抗凝、抑制血小板聚集；提高内生肌酐清除率，促进造影剂的排泄等［20-21］。相关文献［22］报道单味中药提取物有效成分能够有效防治CIN，如黄芩苷能有效提高小鼠体内环磷酸腺苷水平与蛋白激酶A活性，调控蛋白激酶A信号通路，抑制巨噬细胞中ATP诱导的NOD样受体蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎性小体的活化和细胞凋亡；雷公藤多苷能有效抑制ROS-NLRP3炎性通路，达到减轻CIN的效果；冬虫夏草能减少肾小管上皮细胞的凋亡，川芎嗪可以抑制Caspase-3，从而降低肾小管细胞凋亡速度，起到防治CIN的效果；茯苓、茯苓皮、猪苓和泽泻的提取物主要通过利尿作用而减少CIN发生。龚学忠等［23-25］发现制大黄-川芎药对能通过抑制Caspase-3抑制肾小管上皮细胞凋亡及抑制p38 MAPK、Nrf2/HO-1通路活化而保护CIN大鼠的肾功能。郝健等［26］研究发现制大黄-川芎药对可能通过TLR4/Myd88/NF-κB信号通路减少造影剂诱导的炎性细胞因子IL-6、IL-1β的分泌，进而抑制了CIN大鼠肾小管上皮细胞凋亡，发挥保护作用。相关研究［22］发现经方五苓散、防己黄芪汤、防己茯苓汤、五皮散亦具有防治CIN作用，其机制可能与利水渗湿类方剂在稀释造影剂浓度、促进造影剂排泄和减少造影剂在肾脏内的潴留、减轻药物对肾脏Na+-K+-ATP酶活性的抑制有关。

本研究发现茯苓四物汤可以显著降低造影剂诱导的急性肾损伤模型大鼠的BUN、Scr水平，改善模型大鼠肾功能，提示其具有肾保护作用，这可能与茯苓四物汤减轻模型大鼠肾小管上皮细胞损伤、减少肾小管上皮细胞凋亡及抑制Caspase-3表达有关，但具体的作用机制尚需进一步探索研究。