富含半胱氨酸蛋白61对慢性肾脏病小鼠骨骼肌萎缩的影响

古亮 左一丹 林幼幼 王小妹 苏震

慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）是一个全球公共卫生问题，其发病率占全球成年人口的10%～15%[1]。CKD除了可致肾脏功能异常外，还可致多种并发症，肌肉萎缩就是其中之一[2-3]。CKD患者发生肌肉萎缩会使生活质量下降，死亡率上升[4]。已有研究表明，CKD引起肌肉萎缩的原因包括炎症、氧化应激、蛋白合成与分解异常等，这些原因可引起肌肉质量和力量的快速下降，导致肌肉功能丧失[5-6]。富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich protein 61,CCN1）是一种多功能的细胞外基质蛋白，参与细胞黏附、迁移、趋化、分化、凋亡、衰老及伤口愈合、纤维化等过程[7-9]。研究发现，在皮肤伤口愈合过程中，CCN1通过整合素α6β1和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）途径诱导DNA损伤反应激活p53蛋白触发细胞衰老；在成纤维细胞衰老的研究中发现，CCN1可通过RAC1-NOX1复合物诱导活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生，激活ERK和p38MAPK，导致p16/Rb上调[10]。肌肉祖细胞（muscle progenitor cells,MPCs）加入重组CCN1蛋白后，p53、p16和 Rb蛋白表达升高，MPCs衰老表型增强。在老年小鼠血清中CCN1表达明显升高，进一步说明骨骼肌年龄相关性衰老可能与CCN1表达上调有关[11]。基于此，本研究以骨骼肌条件性敲除CCN1小鼠，即条件性基因敲除（conditional knockout,CKO）小鼠为实验动物，构建CKD小鼠模型，探讨CCN1对CKD小鼠骨骼肌萎缩的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 骨骼肌条件性敲除CCN1的小鼠制备 委托江苏南京集萃药康生物科技有限公司通过CRISPR-Cas 9技术在C57BL/6小鼠（购自江苏南京集萃药康生物科技有限公司）CCN1基因上下游各插入一段LoxP序列，得到杂合CCN1flox/+小鼠，将其与CCN1+/+小鼠进行杂交纯化遗传背景。然后本研究团队把纯化后的CCN1flox/+小鼠交配繁殖得到CCN1flox/flox小鼠。CCN1flox/flox小鼠与CKmm-Cre+/-小鼠（购自美国Jackson实验室）杂交，繁殖生育得到CKmm-Cre+/-CCN1flox/+小鼠。随后将异性CKmm-Cre+/-CCN1flox/+与CCN1flox/flox小鼠杂交得到 CKmm-Cre+/-CCN1flox/flox、CKmm-Cre+/-CCN1flox/+、CK－mm-Cre-/-CCN1flox/flox、CKmm-Cre-/-CCN1flox/+4 种基因型小鼠。其中CKmm-Cre+/-CCN1flox/flox为骨骼肌条件性敲除CCN1的小鼠，即CKO小鼠，其中雄性有14只；CKmm-Cre-/-CCN1flox/flox为野生型（wild type,WT）小鼠，其中雄性有15只。将WT小鼠和CKO小鼠按随机数字表法分为野生型假手术组（wild type sham,WOS组）6只、野生型造模组（wild type operation,WOC组）9只、敲除型假手术组（conditional knockout sham,COS组）8只、敲除型造模组（conditional knockout operation,COC组）6只。小鼠置于自然光、安静环境、室温（22±2）℃、相对湿度（50±2）%环境下饲养。本研究经温州医科大学动物伦理委员会批准[批件号：wydw2018-0007；动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009]。

1.1.2 主要试剂和仪器 Mouse Tail SuperDirectTMPCR Kit购自成都福际生物技术有限公司；SAKURA Tissue-TekRO.C.T购自美国樱花公司；抗层粘连蛋白抗体购自美国Abcam公司；荧光山羊抗兔IgG购自中国biosharp公司；DAPI购自北京索莱宝公司；逆转录试剂盒购自中国南京诺唯赞公司；BCA购自中国碧云天公司；肌酐、尿素氮、CCN1、尿蛋白检测试剂盒均购自南京建成生物研究所；HE染色试剂盒购自北京索莱宝公司；GAPDH购自中国Affinity公司；CCN1购自美国Novus Biologicals公司；p53购自美国 Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔 IgG（H+L）购自中国biosharp公司。SpectraMax iD3全波长酶标仪购自美国Molecular Devices公司；Mini-Proten Tetra System电泳系统购自美国 BIO-RAD公司；RM2235轮转式石蜡切片机购自德国Leica公司；LV-150N光学显微镜购自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 构建5/6肾切除小鼠模型 各组小鼠均根据小鼠体重腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg）进行麻醉。WOC组和COC组小鼠在距左肋脊部约0.5 cm处纵行切开约1.5 cm，暴露左侧肾脏，分离肾脏周围组织及包膜，切除左肾上极、下极2/3肾组织，并用明胶海绵迅速覆盖到创面压迫止血，观察肾脏切口直至凝血，复位剩余肾脏，逐层缝合组织；1周后再次用上述方法暴露小鼠右侧肾脏，用手术缝线结扎右肾动脉，切除整个右肾，并逐层缝合。WOS组和COS组小鼠假手术，仅逐层切开暴露肾脏，随后逐层缝合组织。

1.2.2 肌肉取样 将造模21个月后的各组小鼠称重后麻醉、眼球取血并用颈椎脱臼法处死，立即收集胫骨前肌、腓肠肌组织样本并称重。将各组每只小鼠腓肠肌保存于-80℃冰箱，用于real-time PCR和Western blot。将各组每只小鼠胫骨前肌都包埋于OCT中，并浸入液氮预冷的异戊烷中速冻，保存于-80℃冰箱，用于laminin免疫荧光检测。

1.2.3 血清CCN1、肌酐、尿素氮及尿白蛋白肌酐比值测定 收集各组小鼠的血液，4℃静置24 h分层，随后以3 000 r/min离心得到小鼠血清。小鼠处死前7天内，通过动物代谢笼收集尿液。血清及尿液标本根据试剂盒说明书中详细步骤检测得到血清CCN1、肌酐、尿素氮水平及尿白蛋白肌酐比值。

1.2.4 肾脏组织病理学观察 每只小鼠处死后立即取出肾脏并切取约2 mm厚肾组织，4%多聚甲醛固定48 h。常规石蜡包埋，切片。根据HE染色试剂盒说明书染色。每组随机选取3只小鼠各1张肾组织切片，每张切片随机选取3个视野观察小鼠肾脏的病理学改变。

1.2.5 胫骨前肌肌纤维横截面观察 各组小鼠胫骨前肌经冷冻切片机制作7 μm切片，在4%多聚甲醛中固定15 min、5%牛血清白蛋白封闭1 h。加入抗层粘连蛋白抗体（laminin，1∶250）4 ℃过夜。避光加入二抗，室温孵育1 h。滴加抗荧光衰减的DAPI染液20 μl，室温避光孵育10 min；封片。使用荧光显微镜在相同的曝光时间后捕获肌纤维横截面图像。使用 Image J软件在相同条件下处理测量图像中的肌纤维面积，获得各只小鼠胫骨前肌肌纤维横截面积（每只小鼠至少统计6张切片和至少300个肌纤维）。

1.2.6 腓肠肌组织CCN1、肌肉特异性环指蛋白1（muscle RING finger 1,MuRF-1）、肌肉萎缩盒F基因（muscle atrophy F-box,MAFbx）mRNA表达水平检测采用TRIzol法提取腓肠肌组织总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。用SYBRGeen PCR试剂进行real-time PCR。mRNA表达水平标准化为GAPDH表达。采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA表达水平，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.7 腓肠肌组织总蛋白提取 切取各组每只小鼠30 mg的腓肠肌，并向各个组织样本中加入300 μl RIPA。使用组织匀浆器匀浆提取小鼠腓肠肌中蛋白质。使用酶标仪测量蛋白在562 nm波长处的吸光度值。根据BCA法蛋白定量检测法测量匀浆的蛋白质样品浓度。

1.2.8 腓肠肌组织CCN1、p53蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取各组每只小鼠20 μg的腓肠肌组织总蛋白上样到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。恒流将蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶在室温下封闭 PVDF膜1 h。在GAPDH、CCN1、p53一抗中 4℃孵育过夜。洗膜后分别加入对应二抗，室温孵育PVDF膜1 h。洗膜后用ECL化学发光试剂检测。凝胶成像仪观察并拍照。Image J测定灰度值并分析。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值比较 WOC组小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值均高于WOS组小鼠（均P＜0.05），COC组小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值均高于COS组小鼠（均P＜0.05），而COC组小鼠较WOC组小鼠尿白蛋白肌酐比值下降（P＜0.05），见图1。

图1 4组小鼠肌酐、尿素氮、血清CCN1、尿白蛋白肌酐比值比较（a：肌酐水平比较；b：尿素氮水平比较；c：血清CCN1水平比较；d：尿白蛋白肌酐比值比较）

2.2 4组小鼠肾脏组织病理学观察所见 与WOS组、COS组相比，WOC组、COC组小鼠肾脏组织切片可见明显的肾间质纤维化改变；COC组较WOC组肾间质间质纤维化程度减轻，见图2（插页）。

图2 4组小鼠肾脏组织病理学观察所见（HE染色，×200）

2.3 4组小鼠造模后21个月后体重、胫骨前肌、腓肠肌的重量及胫骨前肌体重比值、腓肠肌体重比值比较WOC组小鼠体重、胫骨前肌、腓肠肌的重量及胫骨前肌体重比值、腓肠肌体重比值均低于WOS组小鼠（均P＜0.05），COC组小鼠体重、胫骨前肌、腓肠肌的重量及胫骨前肌体重比值、腓肠肌体重比值均低于COS组小鼠（均P＜0.05），而COC组小鼠较WOC组小鼠腓肠肌、胫骨前肌的重量及腓肠肌体重比值、胫骨前肌体重比值均升高（均P＜0.05），见表2、图3。

图3 4组小鼠胫骨前肌体重比值、腓肠肌体重比值比较（a：腓肠肌体重比值比较；b：胫骨前肌体重比值比较）

表2 4组小鼠造模后21个月后体重、胫骨前肌、腓肠肌的重量比较

2.4 4组小鼠胫骨前肌肌纤维横截面积比较 WOC组小鼠胫骨前肌肌纤维横截面积小于WOS组小鼠（P＜0.05），COC组小鼠胫骨前肌肌纤维横截面积小于COS组小鼠（P＜0.05），而COC组小鼠较WOC组小鼠胫骨前肌肌纤维横截面积大（均P＜0.05），见图4。

图4 4组小鼠胫骨前肌肌纤维横截面观察比较（a：肌纤维横截面镜下观察所见，laminin荧光染色，×200；b:肌纤维横截面积频率分布）

2.5 4组小鼠腓肠肌组织CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表达水平比较 WOC组小鼠腓肠肌组织CCN1、MuRF-1、MAFbxmRNA表达水平均高于WOS组小鼠（均P＜0.05），COC组小鼠腓肠肌组织CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表达水平均高于COS组小鼠（均P＜0.05），而COC组小鼠较WOC组小鼠CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表达水平均降低（均P＜0.05），见图5。

图5 4组小鼠腓肠肌组织CCN1、MuRF-1、MAFbx mRNA表达水平比较（a：CCN1 mRNA表达水平比较；b：MuRF1 mRNA表达水平比较；c：MARbx mRNA表达水平比较）

2.6 4组小鼠腓肠肌组织CCN1、p53蛋白表达水平比较 WOC组小鼠腓肠肌组织CCN1、p53蛋白表达水平均高于WOS组小鼠（均P＜0.05），COC组小鼠腓肠肌组织CCN1蛋白表达水平高于COS组小鼠（P＜0.05），而COC组小鼠较WOC组小鼠腓肠肌组织CCN1、p53蛋白表达水平下降（均P＜0.05），见图6。

图6 4组小鼠腓肠肌组织CCN1、p53蛋白表达水平比较（a：蛋白表达电泳图；b:CCN1蛋白表达水平比较；c：p53蛋白表达水平比较）

3 讨论

CKD的分解代谢环境（包括炎症、激素、代谢性酸中毒和胰岛素抵抗等因素）可激活蛋白质降解，并抑制蛋白质合成，肌肉再生受损导致肌肉萎缩加速[12]。肌肉萎缩在CKD早期即可发生，导致患者生活质量下降和死亡风险增加。细胞外基质在肌肉生长、发育和再生过程中，促进骨骼肌对环境的适应[13]。CCN1由多种类型的细胞分泌至细胞外基质中，介导细胞间信号转导。CCN1参与老年小鼠骨骼肌纤维类型的转变[14]。本研究通过5/6肾切除手术建立CKD小鼠模型，研究CCN1对CKD小鼠骨骼肌萎缩的影响。本研究结果显示CKD造模21个月后的小鼠骨骼肌确实发生明显萎缩。COC组小鼠较WOC组血清CCN1和尿白蛋白肌酐比值均明显下降；肌纤维横截面积、胫骨前肌体重比值、腓肠肌体重比值升高；这些结果表明CKD造模后可导致CCN1升高，肌肉萎缩加剧，而敲除CCN1可以延缓骨骼肌的萎缩。然而，在CKD造模后COC组较WOC组尿白蛋白肌酐比值明显下降，肾间质纤维化程度减轻，提示肌肉敲除CCN1后对肾脏功能可能具有保护作用，具体机制还需进一步分析CKD小鼠肾脏予以验证。

肌肉蛋白的过度降解是肌肉萎缩的主要原因之一[12]。泛素蛋白酶体途径会在多种分解代谢情况下被激活，其中MuRF1和MAFbx是这一过程的经典标志物[15]。本研究结果显示CKD造模小鼠较假手术小鼠MuRF1和MAFbx明显升高，而COC组较WOC组明显下降。这表明骨骼肌敲除CCN1后可以改善CKD分解状态下的骨骼肌萎缩。CCN1可通过p53、p21、p16诱导成纤维细胞的衰老[10，16-17]，参与调节年龄相关性肌萎缩[11]。Fox等[18]研究发现，固定肢体后抑制p53可部分抵抗肌肉萎缩。在恶性肿瘤导致的肌肉萎缩中，肌肉组织p53蛋白表达也明显升高[19]。本研究发现，在21个月CKD小鼠腓肠肌CCN1、p53蛋白表达水平较假手术小鼠升高，而COC组较WOC组明显下降。这表明CKD可以通过CCN1和p53的上调导致骨骼肌萎缩增强；骨骼肌敲除CCN1后可以部分延缓p53蛋白对肌肉的萎缩作用。

综上所述，本研究通过骨骼肌敲除CCN1的小鼠CKD模型，验证了CCN1对CKD骨骼肌萎缩中的影响。CCN1可能通过p53途径促进CKD小鼠骨骼肌衰老和蛋白降解途径加重骨骼肌萎缩。本研究或能为治疗CKD骨骼肌萎缩提供参考。