腹膜透析患者超滤衰竭相关外泌体来源miRNA的初步筛选

吴旭 吴炜飞 程志群 范德墉

随着人口老龄化进程加速，世界范围内慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）的发病率逐年上升。我国流行病学调查研究显示成人CKD的患病率为10.8%，其中肾脏替代治疗患者以每年11.0%以上的幅度递增[1]。腹膜透析作为肾脏替代治疗的主要方式之一使用率逐年上升。超滤衰竭是腹膜透析常见的并发症，是导致腹膜透析失败转血液透析的重要原因之一[2]。随着腹膜透析龄的增长，超滤衰竭的发生率逐渐增高。外泌体是由活细胞分泌的直径为30～150 nm的小囊泡，广泛存在于血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其他生物体液中[3]。miRNA是一类重要的内源性非编码单链小RNA分子，长度为18～24个核苷酸，通过与靶mRNA特异性结合导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从转录后水平调控靶基因的表达[4]。研究表明，miRNA参与腹膜纤维化的发生，导致超滤衰竭，患者不得不退出腹膜透析[5-8]。而外泌体能够携带并递送miRNA至靶细胞进而影响细胞的生物学行为，其参与炎症、细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，从而调节多种病理生理过程，并且其双层膜结构能够保证miRNA在体液中的稳定性[9]。因此外泌体来源的miRNA更适合作为疾病的生物标志物。基于此，本研究通过检测腹膜超滤衰竭患者腹膜透析流出液（peritoneal dialysis effluent,PDE）中外泌体来源miRNA的差异表达谱，探寻可能与腹膜透析超滤衰竭相关的重要miRNA，以期进一步阐明腹膜超滤衰竭的发生机制，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2000年1月至2019年11月在湖州市中心医院肾内科规律随诊的腹膜透析患者30例。排除标准[10]：（1）患者临床资料不全；（2）入组前 3个月内有腹膜炎病史；（3）伴有腹腔出血；（4）合并有肿瘤或严重的心、肝、肺疾病；（5）正在使用糖皮质激素或免疫抑制剂。其中15例患者腹膜平衡试验提示超滤衰竭，为观察组，另15例患者腹膜平衡试验提示无超滤衰竭，为对照组。超滤衰竭判断标准：4.25%葡萄糖透析液留腹4 h后超滤量＜400 ml[2]。本研究经湖州市中心医院医学伦理委员会批准（批件号：20191002-01），患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集患者性别、年龄、置管日期、原发病、24 h尿量、腹膜透析相关性感染总次数、有无糖尿病、有无高血压病等一般资料。

1.2.2 临床指标检测 （1）血生化指标：采集患者清晨空腹静脉血，采用全自动生化分析仪检测血肌酐、血尿素氮、血尿酸、血清白蛋白、TC、血清校正钙、血磷、全段甲状旁腺激素（intact parathyroid hormone,iPTH）、Hb、CRP。（2）总尿素清除指数（Kt/V）及残余肾功能：通过PD Adquest 2.0软件计算总Kt/V；残余肾功能（ml/min）=（尿肌酐/血肌酐+尿尿素氮/血尿素氮）×24 h尿量×7×0.5[11]。（3）腹膜功能：采用标准腹膜平衡试验评估腹膜功能,具体方法如下：患者做腹膜平衡试验的前夜进行标准的连续性不卧床腹膜透析治疗；试验当天，患者取坐位，在20 min内将昨晚留腹的腹膜透析液引流出来，计量。然后患者取卧位，将2 000 ml透析液灌入腹腔，以此定为0 h，在透析液腹腔保留0 h和2 h，收集透析液标本，从腹腔内引流出200 ml液体倒入液袋，上下颠倒2～3次，摇匀后抽取10 ml液体测定肌酐和葡萄糖浓度，剩余的190 ml液体重新灌入腹腔；留腹2 h，抽取血标本，送检血肌酐；留腹4 h后，患者取坐位，用20 min排空腹腔内的透析液，称重并计量，将透析液袋倒转2～3次，摇匀后抽取10 ml液体，检测4 h的 PDE的肌酐与葡萄糖。计算0 h、2 h、4 h透析液与血液中肌酐的比值；计算2 h、4 h与0 h透析液中葡萄糖浓度的比值[2]。

1.2.3 外泌体的分离与鉴定 实验委托上海研载生物技术公司进行。两组患者中随机各抽取3例，收集其500 ml留腹过夜的PDE，4℃超速离心法分离外泌体[12]。具体如下：将PDE以300 g离心10 min，3 000 g离心15 min，12 000 g离心30 min，小心吸取上清液至新管中，去除细胞或细胞碎片。用0.22 μm过滤器过滤，12 000 g离心60 min，去除上清液，留下外泌体粗提沉淀。用PBS重悬沉淀，10 000 g离心60 min，仔细去除上清液，保留的沉淀用200 μl PBS重悬以获得外泌体。

参照Jan等[13]的方法鉴定外泌体。使用透射电子显微镜观察外泌体形态及纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA)技术检测外泌体大小[14-15]。具体如下：将重新悬浮的5～10 μl外泌体溶液（预先用2.5%戊二醛固定）滴加到铜网上，室温吸附5 min左右，然后向铜网上滴加10 μl染色液（饱和醋酸双氧铀溶液），在室温下对外泌体染色处理1 min，在铜网上滴加双蒸水后室温静置5 min，重复1次，将铜网在室温下晾干，上透射电子显微镜观察。外泌体的大小和颗粒密度是通过NanoSight NS300纳米粒径分析仪（英国Malvern Panalytical公司）进行测量。样品在PBS中稀释。使用1×1013个颗粒/ml校准珠对外泌体制剂的密度进行归一化。采用Western blot法鉴定外泌体表面标志物热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）、CD63和CD81蛋白[16]。配制 10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳胶，融解RIPA裂解液，加入苯甲基磺酰氟。加入等体积裂解液，置于冰上放置30 min，每隔10 min摇匀1次，充分裂解外泌体。将蛋白液与上样缓冲液一起混匀后，放入100℃水浴5～6 min，离心，放置冰上，待上样。恒压电泳上层胶60 V，30 min，下层胶110 V，120 min，电泳结束后需要将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，孵育一抗[CD81（武汉爱博泰克生物科技有限公司）、CD63（英国 Abcam 公司）、HSP70（美国 Proteintech公司）均按1∶1 000稀释]，4℃摇床，过夜，洗涤缓冲液洗膜3次，用结合辣根过氧化物酶标记驴抗山羊IgG二抗（上海碧云天生物技术有限公司）室温孵育1 h，洗膜后使用电化学发光试剂在超敏化学发光成像系统（美国GE公司）下显影。

1.2.4 外泌体来源miRNA高通量测序与分析 实验委托上海研载生物技术公司进行。参照试剂说明书，使用 RNAiso Plus试剂（日本TAKARA公司）从外泌体中提取总 RNA。每250 μl外泌体样品加入750 μl Trizol裂解，然后加入200 μl氯仿分离液。在上层液体中加入异丙醇，从外泌体悬浮液中沉淀RNA。用75%乙醇悬浮，4℃ 12 000 g离心5 min。将沉淀溶解在20 μl焦碳酸二乙酯中。通过计算260 nm与280 nm的光密度（OD）比值评估 RNA纯度。TruSeq miRNA样品制备试剂盒（美国Illumina公司）用于 RNA文库构建。 通过 ACGT101-miR软件（美国LC Sciences公司）进行数据预处理。随后根据miRbase数据库（http://www.mirbase.org/）从PDE外泌体中鉴定出miRNA。应用DESeq算法筛选差异表达的miRNA，即以1，伪发现率（false discovery rate,FDR）＜0.05为标准。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0及GraphPad Prism 7统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料以频数和构成比表示，两组比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 两组患者性别、原发病、有无合并糖尿病或高血压及Hb、CRP、TC、血尿素氮、血肌酐、血尿酸、血清校正钙水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与对照组相比，观察组患者年龄大、透析龄长、首次透析时间早、腹膜透析相关性感染总次数多、腹膜转运特性为高转运比例高，血白蛋白、总Kt/V及残余肾功能均偏低，血磷及iPTH均偏高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者临床资料比较

2.2 PDE外泌体分离后鉴定结果 NTA结果显示，检测的粒子直径为50～150 nm，峰值主要集中在142 nm（图1）；Western blot检测结果显示，所提取的外泌体的蛋白条带与阳性对照条带分子量相同，外泌体特异性表达 HSP70、CD63和 CD81蛋白（图 2）；透射电子显微镜观察可见PDE来源的外泌体外形呈椭圆形（图3）；荧光染色结果显示，PDE来源的外泌体能成功被腹膜间皮细胞摄取（图4，见插页）。

图1 PDE外泌体颗粒直径和浓度分布的NTA结果

图2 外泌体HSP70、CD63和CD81蛋白表达电泳图（1：阳性对照；2：本研究所提取的外泌体）

图3 透射电子显微镜下外泌体的形态（×100 000）

图4 共聚焦激光显微镜观察到PKH67标记外泌体被腹膜间皮细胞摄取（×800）

2.3 两组患者PDE外泌体来源miRNA的差异表达情况 高通量测序结果显示，与对照组相比，观察组PDE外泌体中存在70个有明显表达差异的miRNA，其中41个表达上调，29个表达下调(图5，见插页)，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。表达上调、下调差异倍数前19位的 miRNA见表2。

表2 两组患者PDE外泌体来源差异miRNA表达谱

图5 两组患者PDE外泌体来源miRNA表达差异火山图

3 讨论

随着腹膜透析技术的不断发展及我国政府的大力支持，腹膜透析已成为我国终末期肾脏病（end-stage renal disease,ESRD）患者成熟的肾脏替代治疗方式之一[17]。其优势在于能连续清除毒素、较少影响患者活动和较低的治疗费用。然而，持续暴露于葡萄糖透析液、机械应力、导管并发症等均可引起腹膜的炎症与损伤，从而促使腹膜经历渐进性血管生成和纤维化，促使腹膜有效表面积改变、葡萄糖渗透转导作用下降，最终导致超滤衰竭[18]。外泌体来源miRNA在细胞间物质和信号转递中至关重要，参与炎症、细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程，从而可能调节多种病理过程[19]。

本研究结果显示，与对照组相比，观察组患者年龄大、透析龄长、首次透析时间早、腹膜透析相关性感染总次数多、腹膜转运特性为高转运比例高，血白蛋白、总Kt/V及残余肾功能均偏低，血磷及iPTH均偏高，这与陈嫚等[17]和Sumi等[20]的研究结果相符。两组患者PDE外泌体来源miRNA进行高通量测序，并通过生物信息学分析，统计miRNA显著差异表达情况。结果显示，观察组PDE外泌体中显著差异表达的miRNA共有70个，其中hsa-miR-125a-3p_R-1、hsa-mir-1273c-p3、hsa-miR-132-3p等 41个表达上调，hsamiR-708-5p、hsa-miR-155-5p_R-1、bta-mir-2904-2-p5等29个表达下调，这说明与对照组相比，腹膜透析超滤衰竭组PDE外泌体来源miRNA表达谱发生了明显的变化。

miR-125a、miR-1273g-3p、miR-708-3p 和 miR-155-5p参与脏器纤维化已有相关文献支持。例如，He等[21]研究显示miR-125a在人酒精和丙型肝炎病毒相关肝纤维化组织和CCL-4诱导的小鼠肝纤维化组织中的表达均高于正常对照组。使用miRNA微阵列的研究表明，miR-1273g-3p在丙型肝炎病毒相关肝纤维化患者中表达上调[22]。特发性肺纤维化患者的血浆和组织样本中，miR-708-3p的表达水平是降低的。microRNA-708-3p通过调节ADAM17-GATA/STAT3轴，阻断肺纤维化[23]。亦有研究表明，miR-708在肝纤维化组织中表达是下调的[24]。miR-155-5p通过抑制SIRT1信号通路促进梗阻性肾病的肾间质纤维化[25]。因此推测上述miRNA在逆转腹膜纤维化方面可能也有类似作用，而腹膜纤维化是导致腹膜透析超滤衰竭的常见原因之一，故上述miRNA也可能参与腹膜超滤衰竭。

综上所述，腹膜透析超滤衰竭患者外泌体来源miRNA表达谱发生明显改变。腹膜透析超滤衰竭患者的PDE外泌体存在多种miRNA表达的失调，提示miRNA可能参与腹膜超滤衰竭的发生。笔者团队下一步将对这些差异表达的miRNA进行靶基因的预测及功能分析，进一步探讨腹膜透析超滤衰竭的发生、发展机制，以期寻找新的防治方法。