白藜芦醇对脓毒症小鼠急性肾损伤的保护作用和机制研究

蔡涵晖 刘景全 邵自强 林宗斌 梁天宇 杨向红

急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是脓毒症常见的并发症之一。脓毒症相关性急性肾损伤（sepsisassociated AKI,S-AKI）是一种急性功能损害和器官损害综合征。患者一旦发生，不仅延长住院时间，更重要的是与不良预后密切相关，死亡风险大幅增加[1-2]。因此，S-AKI早期诊断并及时干预将有助于降低患者病死率，并提高其生存质量。沉默信息调节相关酶1（sirtuin 1,SIRT1）是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）的去乙酰化酶。研究发现，SIRT1具有肾脏保护作用，如减轻氧化应激损伤、诱导线粒体再生以及抑制肾小管细胞凋亡等[3-5]。白藜芦醇作为SIRT1的天然激活剂，研究认为其能缓解脓毒症所致肾损伤，主要通过调控炎症细胞介导的肾脏微环境和炎症反应来实现[6-7]。然而，近年来肾小管上皮细胞凋亡被认为可能在S-AKI的发生、发展中起重要作用[8]。白藜芦醇是否能干预S-AKI中肾小管上皮细胞的凋亡及其作用机制如何，尚待研究探讨。因此，本研究采用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）术构建脓毒症小鼠模型，旨在探讨白藜芦醇是否通过调节SIRT1蛋白的表达干预肾小管上皮细胞的凋亡，达到保护肾功能的目的，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂 清洁级C57BL/6小鼠（雄性，6～8周龄，体质量20 g左右）由杭州医学院提供，实验动物生产许可证：SYXK（浙）2019-0011。本动物实验获杭州医学院实验动物管理委员会伦理批准（编号：ZJCLA-IACUC-20030023）。白藜芦醇购自美国MCE 生物有限公司（200 mg/瓶，粉剂，批号：HY-16561）。肾损伤标志物-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的ELISA试剂盒购自美国Elabscience公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenFast qPCR Mix购自宝日医生物技术（北京）有限公司。PierceTMECL Western Blotting Substrate、Thermo Fisher/Pierce BCA Protein Assay Kit试剂盒购自英国Thermo Fisher公司。SIRT1抗体、半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase 3）抗体购自美国CST公司。Tunel细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脓毒症小鼠模型的制备和分组 将45只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham组）、脓毒症模型组（CLP组）和白藜芦醇实验组（CLP+白藜芦醇组），每组15只。采用CLP术构建脓毒症模型[9]。术前所有小鼠禁食12 h，以1%戊巴比妥钠注射液50 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒铺无菌巾，沿腹部正中线作约1 cm左右切口，在回盲瓣远侧用4号缝合线结扎盲肠，结扎范围为整个盲肠的1/3左右。用18号针贯穿盲肠2次，挤出少许肠内容物。之后，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。术毕在股部皮下注射37℃0.9%氯化钠溶液30 ml/kg进行液体复苏。术后3 h开始予皮下注射亚胺培南/西司他丁25 mg/kg治疗，每12 h重复1次，共2 d。Sham组除不结扎及盲肠穿孔，其余步骤与上述相同。CLP+白藜芦醇组行CLP术后，给予10 mg/kg剂量白藜芦醇0.4 ml灌胃，1次/d，连续7 d；Sham组及CLP组，予0.4 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.2.2 肾功能指标检测 术后72 h每组取5只存活小鼠，将小鼠以1%戊巴比妥钠注射液50 mg/kg麻醉后，采用眼球摘除法收集2 ml血液，3 000 r/min离心10 min后提取血清。采用全自动生化分析仪测定小鼠血清中尿素氮及肌酐水平，剩余血清存于-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 肾脏组织病理学观察 术后72 h每组取5只小鼠肾脏迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，切片机切成约5 μm厚的切片，HE染色，之后在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.4 肾损伤标志物检测 术后72 h收集的每组小鼠血清，再按照ELISA试剂盒说明书操作，检测NGAL、KIM-1水平。

1.2.5 肾细胞凋亡检测 取前述肾组织石蜡切片，按照Tunel凋亡检测试剂盒说明书操作。凋亡细胞染色后，镜下观察其核呈现棕黄色，在高倍镜下随机选5个视野，每个视野选100个细胞，综合5个视野中凋亡细胞所占比例，得出细胞凋亡率（%），即细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 肾脏组织SIRT1 mRNA和蛋白表达水平检测 采用RT-qPCR法检测SIRT1 mRNA表达。取各组小鼠新鲜肾脏皮质组织100 mg，用Trizol试剂提取总RNA，通过紫外分光光度计对样品RNA进行测定，测定OD260/OD280值在1.8～2.0，按照逆转录试剂盒说明书步骤逆转录合成cDNA，荧光定量的反应体系和条件严格按照厂商说明书进行设定，内参基因使用GAPDH，SIRT1 mRNA的相对表达水平通过2-ΔΔCt计算。

采用Western blot法检测SIRT1蛋白表达水平。取各组小鼠肾组织经细胞裂解提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。各组组织蛋白（15 μg）依次在10%SDS/PAGE行凝胶电泳分离，湿转法转移到PVDF膜上。经5%的脱脂牛奶室温下封闭2 h后，PVDF膜在SIRT1（1∶300）和 β-actin（1∶6 000）的一抗管中 4 ℃孵育过夜。TBST液洗涤3次，接着加入对应的辣根过氧化物酶耦联的二抗管中，室温孵育1 h，滴加ECL发光液并通过BioRad系统成像，以β-actin作为内参，ImageLab软件分析结果。

1.2.7 肾脏组织Caspase 3表达检测 采用免疫组织化学法。取前述制备的各组小鼠肾组织石蜡切片脱蜡至水，滴加兔抗Caspase 3抗体，4℃过夜孵育，DAPI复染细胞后封片，每张切片随机取5个高倍视野观察并拍照。Caspase 3阳性染色定位以细胞质为主，以出现均匀完整的细胞质着色定为阳性细胞。使用Image J软件中的IHC Profiler对免疫组化染色后的切片进行图像分析并予评分。依据IHC Profiler给出的结果：高阳性区、阳性区、低阳性区和阴性区分别对应4、3、2、1分，最后依据下述公式计算评分。评分=（高阳性区域面积×分数+阳性区域面积×分数+低阳性区域面积×分数+阴性区面积×分数）/图片总面积。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠肾功能指标比较 3组小鼠血肌酐和尿素氮水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Sham组相比，CLP组小鼠血肌酐和尿素氮水平均升高（均P＜0.05）；CLP+白藜芦醇组小鼠血肌酐和尿素氮均较CLP组降低（均P＜0.05），但较Sham组仍升高（均 P＜0.05），见表 1。

表1 3组小鼠肾功能指标比较

2.2 3组小鼠肾脏组织病理学变化 Sham组小鼠的肾脏组织结构清晰，肾小管、肾小球正常，肾小管上皮细胞未见变性、萎缩、肿胀坏死或炎症细胞浸润，管腔无扩张；CLP组小鼠肾脏肾小球毛细胞血管扩张、充血，肾小管上皮细胞水肿、颗粒性变样或空泡变性，管腔缩小，大量炎症细胞浸润；CLP+白藜芦醇组肾小球毛细胞血管扩张不明显，炎症细胞浸润较CLP组减轻。见图1（插页）。

图1 3组小鼠肾脏组织病理学观察所见（HE染色，×200）

2.3 3组小鼠血清肾损伤标志物水平比较 3组小鼠血清NGAL、KIM-1水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Sham组相比，CLP组小鼠血清NGAL和KIM-1水平均升高（均P＜0.05）；CLP+白藜芦醇组小鼠血清NGAL、KIM-1均较CLP组降低（均P＜0.05），但较Sham组仍升高（均P＜0.05），见表2。

表2 3组小鼠血清肾损伤标志物水平比较（ng/ml）

2.4 3组小鼠肾脏细胞凋亡情况比较 3组小鼠肾脏细胞凋亡率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与Sham组相比，CLP组小鼠肾脏细胞凋亡率升高（P＜0.05）；CLP+白藜芦醇组小鼠肾脏细胞凋亡率较CLP组降低（P＜0.05），但仍较 Sham 组升高（P＜0.05）。见图 2（插页）。

图2 3组小鼠肾脏细胞凋亡情况比较（a：Tunel染色镜下所见，×200；b：细胞凋亡率比较）

2.5 3组小鼠肾脏组织SIRT1 mRNA、蛋白表达水平比较 3组小鼠肾脏组织SIRT1 mRNA、蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CLP+白藜芦醇组小鼠肾脏组织SIRT1 mRNA、蛋白表达水平＞CLP 组＞Sham 组（均 P＜0.05），见图 3、4。

图3 3组小鼠肾脏组织SIRT1 mRNA表达水平比较

图4 3组小鼠肾脏组织SIRT1蛋白表达水平比较（a：蛋白表达电泳图比较；b：蛋白表达水平比较）

2.6 3组小鼠肾脏组织Caspase 3表达情况比较 Caspase 3染色主要位于细胞质，呈细颗粒棕黄色。Sham组肾脏组织Caspase 3表达很少。与Sham组相比，CLP组肾脏组织Caspase 3表达明显上调（P＜0.05），大部分远曲小管呈Caspase 3阳性反应。CLP+白藜芦醇组肾脏组织Caspase 3表达较CLP组下调（P＜0.05），但仍高于 Sham 组（P＜0.05）。见图 5（插页）、6。

图5 3组小鼠肾脏组织Caspase 3表达情况比较（免疫组化染色，×200）

图6 3组小鼠肾脏组织Caspase 3表达免疫组化染色评分比较

2.7 3组小鼠存活率比较 各组剩余的小鼠饲养至7 d，发现Sham组小鼠10只全部存活，7 d存活率100%；CLP组小鼠在第3天累计死亡9只，最终在第4天全部死亡，7 d存活率0%；CLP+白藜芦醇组小鼠日死亡数量基本平稳，在第 1、2、4、5、6 天各死亡 1只，第3天死亡2只，在第7天仍存活3只，存活率30%。生存分析显示，CLP+白藜芦醇组与CLP组小鼠7 d存活率比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

图7 3组小鼠存活率比较

3 讨论

白藜芦醇具有多种生物学活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、改善胰岛素抵抗等[10-11]，具有一定的肾脏保护作用[6，12-13]。研究发现，无论是原发性（尿毒症大鼠模型）还是继发性肾损伤（糖尿病性肾损伤大鼠模型），白藜芦醇的干预能减轻实验动物的肾损伤并改善其肾功能，提高存活率[12-13]。笔者团队在研究白藜芦醇对S-AKI的保护作用基础上也发现CLP+白藜芦醇组小鼠血清肌酐、尿素氮以及肾损伤标志物均较CLP组明显降低，提示肾脏细胞损伤减轻，肾功能明显好转。而且，CLP+白藜芦醇组小鼠的存活时间大大延长。目前，大多数研究认为白藜芦醇缓解脓毒症所致肾损伤，主要通过调控炎症细胞介导的肾脏微环境和炎症反应来实现[6-7]。但是，也有学者发现，尽管脓毒症与非脓毒症AKI有着相似的肾功能损伤，但脓毒症肾脏中的急性肾小管坏死及炎症较少，反而见到一定数量的凋亡肾小管细胞[8]。而在本研究中，同样发现脓毒症小鼠可见较多凋亡的肾小管上皮细胞，肾组织中促凋亡蛋白Caspase 3的表达也相应增加。而经白藜芦醇干预的脓毒症小鼠，肾小管上皮细胞凋亡及肾组织凋亡蛋白的表达相应减少。这提示肾小管上皮细胞凋亡参与了S-AKI，而白藜芦醇可减轻脓毒症小鼠肾小管上皮细胞的凋亡。

SIRT1是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶，具有保护和维持肾脏细胞功能的作用[6，14]。Opal等[15]发现SIRT1激活剂STAC SRT3025的使用能降低脓毒症实验动物的病死率。白藜芦醇作为SIRT1的天然激活剂，它对肾脏的保护也可能通过激活SIRT1相关通路实现。本研究发现经白藜芦醇处理的脓毒症小鼠，SIRT1在mRNA和蛋白水平的表达均显著升高同时其促凋亡蛋白Caspase 3的表达降低，肾功能好转。因此，笔者认为白藜芦醇减轻脓毒症相关肾损伤的机制之一，可能是通过SIRT1抑制凋亡通路的激活实现的。

本研究发现，与Sham组相比，CLP组小鼠肾脏组织SIRT1表达水平升高。Kim等[16]的研究与本研究有相似的发现，该研究用顺铂处理C57BL/6小鼠诱导AKI，发现SIRT1的表达于6 h开始增加，至第5天达高峰，第14天开始下降，他们认为这与肾损伤初期自我保护机制促使机体进行肾脏自我修复，通过短暂上调SIRT1表达相关。但是，这与Xu等[17]的研究结果不符，他们发现CLP组SD大鼠SIRT1的表达和活性被抑制，尤其在造模后8 h降至最低。本研究虽与Xu等[17]造模方式相同，但选用的实验动物却不同。笔者推测SIRT1检测结果不同是否与实验动物的个体差异相关。因此，后续仍需进一步实验研究探讨SIRT1在不同AKI模型以及不同种类动物脓毒症模型中的表达情况。同时，本研究也存在一定的局限性。脓毒症疾病是一个动态变化的疾病进程，这是CLP进行脓毒症造模所不能控制的。因此，与临床中的脓毒症存在一定的差异。另外，本研究并未对白藜芦醇存在的不良反应进一步研究。后续将针对这些不足和缺陷再加以完善和验证。

综上所述，白藜芦醇可能通过激活SIRT1信号抑制凋亡通路从而抑制肾小管上皮细胞凋亡，减轻S-AKI程度。这或为临床应用白藜芦醇治疗S-AKI提供了一定的理论和实验依据。