禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法的建立与初步评估

王国康 ， 卢 琴 ， 贾妙妙 ， 李 丽 ， 冯贺龙 ， 邵华斌 ， 罗青平 ， 曾 驰 ， 温国元

(1. 武汉轻工大学生物与制药工程学院 ， 湖北 武汉 430023 ； 2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 湖北 武汉 430064 ； 3. 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室 ， 湖北 武汉 430064 ； 4. 畜禽病原微生物学湖北省重点实验室 ， 湖北 武汉 430064)

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)是家禽和野禽的常见传染病病原，一般呈感染率高、发病率低等特点，以隐性感染的形式普遍存在于鸡群中。在家禽免疫力低下、存在免疫抑制病或多病原混合感染时会导致感染的禽群发病。FAdV为腺病毒科禽腺病毒属成员，其基因组为单股双链DNA[1]。FAdV分为I、II和III共3个群，其中I群又分为A、B、C、D和E共5个亚群，包含12个血清型[2-3]。FAdV的主要结构蛋白有五邻体(Penton)、六邻体(Hexon)、纤突(Fiber)蛋白以及衣壳蛋白pⅠ、pVⅡ、PIIIa等，以这些蛋白为主构成了病毒粒子的核衣壳[4-5]。

2015年以来，鸡心包积水-肝炎综合征(Hydropericardium hepatitissyndrome,HHS)疫情在我国大面积流行，对养鸡业造成了严重的经济损失。FAdV血清4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是HHS的病原，被归为I群C亚群，为我国当前主要流行的血清型[6]。与其他血清型相比，FAdV-4对鸡的致病性较强。发病鸡通常出现食欲不振、贫血、羽毛杂乱、鸡冠颜色变浅等症状，随后在3～5周龄突然死亡，并伴有淡黄色心包积液，偶有在肝脏形成包涵体，死亡率30%～90%[7]。由于FAdV-8和FAdV-11等其他血清型也在禽群中存在一定程度的感染。因此，为便于开展HHS的流行病学及临床检测等工作，有必要建立一种针对FAdV-4的病原学检测方法。

目前，针对FAdV-4的检测方法主要有琼脂扩散试验、酶联免疫吸附法、病毒分离鉴定和常规 PCR方法等[8]。荧光PCR方法是在常规PCR的基础上引入了荧光探针，其检测特异性和敏感性得到了增强，在特异检测FAdV-4病原方面具有一定的优势[9]。本研究以FAdV-4的Hexon基因为扩增靶区，设计了PCR引物和TaqMan探针，通过检测条件的优化，建立了FAdV-4荧光定量PCR检测方法，以期为该病的病原学监测和疫情诊断提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病毒和样品 FAdV-4 HB1510株、鸡减蛋综合征病毒HB76株、新城疫病毒LaSota株、鸡传染性支气管炎病毒H120株、H9N2禽流感病毒JM0305株和鸡大肠杆菌SS17-38株，均由本实验室保存。65份组织样品采集自湖北省武汉市新洲区和汉川市的养鸡场。

1.2 试剂和主要仪器 DNA提取试剂盒，购自美国 Axygen公司；荧光定量专用预混液(探针法)AceQ qPCR Probe Master Mix、快速PCR 2×Rapid Taq Master Mix，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Trans2K Plus DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；DL2 000 DNA Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光定量PCR仪为Bio-Rad公司生产的iQ5 Real Time PCR System。

1.3 引物和探针序列的设计合成 对NCBI上GenBank中的FAdV-4Hexon基因序列进行比对，选取其中相对保守的区域。根据保守区域序列，应用Primer Express 3.0软件设计了2对引物和1条探针(表1)，分别用于荧光定量PCR和常规PCR检测。探针的5′端以荧光报告基团FAM标记，3′端以荧光淬灭基团TAMRA标记。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 FAdV-4 荧光定量PCR和常规PCR方法的引物和探针序列

1.4 病毒核酸提取及标准品制备 病毒基因组提取采用小量DNA提取试剂盒，细菌基因组的提取采用细菌基因组提取试剂盒。提取的病毒和细菌基因组在-80 ℃保存待用。将FAdV-4细胞毒(105.0EID50/mL)进行10倍连续梯度稀释，直至10 EID50/mL， 稀释后的样品即可作为检测标准品。

1.5 荧光定量PCR检测方法 荧光定量PCR反应体系：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，PCR引物对(FAdV-F和FAdV-R)各1 μL，荧光探针(FADV-P)1 μL，DNA模板1 μL，加水补至20 μL。荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火和延伸35 s，50个循环。在此基础上，分别对引物及探针浓度、退火温度及循环次数进行优化。

1.6 常规PCR检测方法 常规PCR反应体系：2× Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，PCR引物对(hexon-F和hexon-R)各1 μL，DNA模板1 μL，加水补至20 μL。 常规PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

1.7 临床样品的检测 临床采集的组织样品按照1∶10(组织体重∶PBS体积)的比例加入PBS(pH 7.4)，充分匀浆处理，高速离心去除沉淀。收集上清进行病毒基因组DNA的提取，用建立的荧光定量PCR和常规PCR方法进行检测，分析结果，比较两者的检测符合率。

2 结果

2.1 扩增靶区的选择 对NCBI上GenBank数据库中的各种血清型FAdV的Hexon序列进行比对分析，确定了一段在FAdV-4内高度保守、与其他血清型FAdV存在较大差异的序列。以该序列为扩增靶区，设计合成了PCR引物和TaqMan荧光探针。如图1所示，引物和探针序列与FAdV-4的毒株序列高度匹配，与我国流行的其他2种血清型FAdV-8和FAdV-11匹配性较差，FAdV-8不匹配碱基与总碱基之比分别为FAdV-F：10/16，FAdV-R：14/21，FAdV-P：9/22；FAdV-11不匹配碱基与总碱基之比分别为FAdV-F：9/16，FAdV-R：12/21，FAdV-P：10/22。序列分析结果表明，设计的引物和探针序列具有较好的FAdV-4特异性。

图1 荧光定量PCR的引物和探针与不同血清型FAdV毒株的序列匹配结果

2.2 荧光定量PCR检测条件的优化 经过各种检测条件的优化试验，确定了荧光定量PCR检测的反应体系及反应条件。反应体系：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，上下游引物终浓度为0.1 μmol/L，探针的终浓度为0.4 μmol/L，DNA模板为1 μL，最终加水补至20 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火35 s，40个循环，在每个循环60 ℃退火阶段收集荧光信号。

2.3 荧光定量PCR检测方法的敏感性试验 采用优化的FAdV-4荧光定量PCR检测条件，对梯度稀释的FAdV-4标准品(104、103、102EID50/mL和10 EID50/mL)进行病毒基因组DNA提取及荧光PCR反应，得到荧光定量PCR扩增动力学曲线(图2)和标准曲线(图3)。结果表明，荧光定量PCR可检测到病毒的最低浓度为10 EID50/mL。 在104～101EID50/mL 的浓度范围内，病毒滴度与Ct值呈良好的线性关系，标准曲线的线性回归方程为y=-3.286x+47.786，相关系数为0.994，扩增效率为101.5%。以常规PCR方法对上述标准品进行检测，能够检测出的最低病毒滴度为102EID50/mL(图4)。荧光定量PCR方法的检测敏感性比常规PCR高10倍。

图2 FAdV-4荧光定量PCR检测方法的标准曲线

图3 FAdV-4荧光定量PCR检测方法的扩增动力学曲线

图4 FAdV-4常规PCR检测方法的敏感性检测结果

2.4 荧光定量PCR检测方法的特异性试验 建立的FAdV-4荧光定量PCR检测方法，对FAdV-4 HB1510株、鸡减蛋综合征病毒HB76株、新城疫病毒LaSota株、鸡传染性支气管炎病毒H120株、H9N2禽流感病毒JM0305株和鸡大肠杆菌SS17-38株进行检测。结果显示，仅有FAdV-4检测为阳性，其余样品与空白对照检测均为阴性，表明该检测方法具有较好的特异性。

2.5 荧光PCR检测方法的重复性试验 建立的FAdV-4荧光PCR检测方法，对4份FAdV-4临床阳性组织样品进行重复性检测，以分析其组内与组间重复性。结果表明，组内重复性试验中，Ct值的变异系数CV在0.31%～0.55%；组间重复性试验中，Ct值的变异系数CV在0.44%～1.12%(表2)。组内和组间变异系数均较小，表明建立的FAdV-4荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性。

表2 FAdV-4荧光定量 PCR的重复性检测结果

2.6 荧光定量PCR检测方法的临床应用 5份临床采集的组织样品同时进行FAdV-4荧光定量PCR和常规PCR检测。结果如表3所示，荧光定量PCR检测的阳性数为9份，常规PCR检测的阳性数为3份。与常规PCR方法相比，荧光定量PCR方法的检测符合率为90.7%(59/65=90.7%)，检测敏感性为100%(3/3=100%)，检测特异性为90.3%(56/62=90.3%)。

表3 FAdV-4荧光定量PCR和常规PCR的临床样品检测比较

3 讨论

1987年3月由FAdV-4引起的HHS在巴基斯坦的安卡拉地区首次暴发，随后世界各地相继出现HHS疫情[10]。我国HHS疫情在2010年以后呈现了上升趋势，以2015年为分界线。2015年以前，仅有零星HHS疫情发生，但2015年之后，我国许多省市相继暴发HHS疫情，且疫情范围仍在不断扩大，给我国养鸡业带来了严重的经济损失[11]。为监测FAdV-4病原流行情况和疫情诊断，急需一种特异、敏感的FAdV-4病原检测方法。

当前FAdV-4的检测方法主要有琼脂扩散、酶联免疫吸附和常规PCR等方法。由于FAdV-8和FAdV-11等其他血清型毒株的临床感染情况较为普遍，这对FAdV-4的特异性检测造成了一定程度的干扰[12]。荧光定量PCR技术以其高灵敏度、高特异性、检测速度快等优点，在病原的定性和定量检测方面得到了广泛应用[9]。该技术可分为染料法和探针法。染料法中的荧光染料主要与双链DNA分子结合，所以当出现引物二聚体、单链二级结构和非特异性扩增产物时，也会产生荧光信号，导致出现假阳性[13-14]。Hexon基因保守区段GC含量较高，扩增时易产生引物二聚体，从而影响检测结果[15]。TaqMan探针法通过要合成标记有荧光染料的探针，即使有1个碱基突变也会影响探针的结合及检测效果，具有较高的检测特异性[13-16]。Hexon蛋白是FAdV病毒核衣壳的重要组成部分，具有群、亚群及型特异性的抗原决定簇[17-18]，是实现FAdV-4特异检测的优选基因。

本研究通过对Hexon基因序列比对分析，设计合成了PCR引物和TaqMan荧光探针，其序列与FAdV-4的毒株高度匹配，而与其他血清型FAdV匹配性较差。经过引物、探针的浓度、退火温度和循环数等一系列检测条件优化之后，建立了快速检测FAdV-4的荧光定量PCR检测方法。敏感性试验中，TaqMan探针荧光定量PCR检测方法比常规PCR检测方法高10倍。特异性试验中，用各种病毒的核酸进行荧光定量PCR检测，除了FAdV-4外，其他病原均未出现有效扩增，表明特异性良好。重复性试验中，组内重复和组间重复变异系数均较小，说明重复性较好。临床样品检测中，与常规PCR方法相比,荧光定量PCR方法的检测符合率为90.8%，诊断灵敏度为100%，诊断特异性为90.3%。综上，FAdV-4荧光定量PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好、操作简单快速，可为我国FAdV-4的流行病学监测和疫情诊断提供有力的技术支撑。