常德地区鸡场致病性大肠杆菌血清型鉴定

2014-08-12李娜张保平王文彬等

江苏农业科学 2014年6期

李娜+张保平+王文彬+等

摘要：采集湖南省常德地区3个鸡场病料105份，并采用玻板凝集法进行了O抗原血清型鉴定。结果发现，105份鸡场病料经分离鉴定出致病性大肠杆菌60株，30株鉴定出抗O血清型。该地区流行优势血清型为O55（5株）、O111（9株）、O78（15株），分别占16.67%、30%、50%。3种优势血清型占总定型菌株的96.67%（29/30）。

关键词：鸡；致病性大肠杆菌；血清型

中图分类号： S858.315.1+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0171-02

收稿日期：2013-09-21

基金项目：湖南文理学院青年专项基金（编号：QNYX0811）；湖南省常德市指导性科技计划（编号：2006ZD24）；湖南省“十二五”重点建设学科（动物学）项目（编号：湘教发[2011]76号）；湖南省高校科技创新团队项目（编号：2008244）；湖南省动物学重点实验室项目（编号：200824632 ）。

作者简介：李娜（1977—）女，吉林长春人，硕士，讲师，研究方向为预防兽医学。E-mail：vetlina@163.com。鸡大肠埃希菌病是一种危害各年龄、各品种鸡的传染性疾病，其病原为大肠杆菌（Escherichia coli），具有多种血清型。该病的主要特征包括心包炎、肝周炎、脐炎、气囊炎、败血症、眼炎、滑膜炎、卵黄性腹膜炎等，多继发新城疫、传染性喉气管炎等疾病，导致鸡群高死亡率，对鸡养殖产业危害极大[1]。有关鸡大肠杆菌病流行病学的研究，国内已有很多报道，主要涉及我国的主要省（市、区），而对县（市、区）研究得不多。由于大肠杆菌血清型多，抗原复杂，小区域之间也存在较大差异，为了能准确地防治鸡大肠杆菌病，应在尽可能小的区域内对其进行病原血清型调查，目前对常德及周边区域鸡场大肠杆菌的主要血清型分布情况的调查研究还未见报道。因此，笔者从2006年10月至2012年12月对湖南省常德地区的鸡大肠杆菌病流行情况及血清型进行调查，查清本地的主要流行菌株，为疫苗研制和选用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料采集2006年10月至2012年12月期间，选取湖南省常德地区饲养的疑似大肠杆菌病鸡的脏器105份，患病鸡症状主要表现败血症、气囊炎、心包炎、肝周炎、滑膜炎、输卵管炎和眼炎等。无菌采集病死鸡的心包、心血、肝、脾、气管、腹水和卵黄囊内明显病变的组织。

1.1.2培养基及试剂普通琼脂平板培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、伊红美兰（EMB）琼脂培养基、麦康凯（MAC）琼脂培养基购自北京奥博星生物技术责任有限公司；生化试验微量发酵管购自浙江省杭州微生物试剂有限公司；肠道致病性大肠杆菌诊断血清（含15种血清型），购自浙江省宁波天润生物药业有限公司；普通营养肉汤为自制。

1.1.3试验动物18～25 g小白鼠，购自湖南农业大学小动物室。

1.2方法

1.2.1细菌形态与分离培养将新鲜采集的病料划线接种于普通培养基、MAC培养基、 EMB培养基上和穿刺TSI琼脂管，置于37 ℃恒温箱中培养18～24 h后观察，挑取疑似的单个菌落进行革兰氏染色镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌的菌株划线接种于普通营养琼脂平板进行细菌的数次纯化，然后将纯化好的细菌接种于普通斜面培养基上4 ℃保存备用。

1.2.2生化特性鉴定将分离的60个菌株接种普通肉汤，37 ℃恒温箱培养24～48 h后适量接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基质、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR、VP微量发酵管，置于37 ℃恒温箱培养24 h后观察生化反应结果。靛基质滴加靛基质试剂，MR滴加MR试剂1滴即刻观察结果；VP滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴，置于37 ℃培养2 h后观察结果。

1.2.3大肠埃希菌致病性试验取已鉴定出生化反应符合大肠杆菌的菌株的37 ℃恒温箱培养18 h的普通肉汤培养物（菌液浓度为30亿CFU/mL），经纯粹检验合格，分别腹腔接种18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只剂量接种，每个菌株接种6只，对照组经相同的途径接种0.2 mL普通肉汤培养液，接种6只。接种后饲养观察存活情况120 h，记录小白鼠的死亡时间并对死亡的小白鼠剖检取其肝脏、心脏后，用EMB平板进行接种菌回收试验以分离致病菌。

1.2.4分离菌O血清型鉴定将以上鉴定出的致病性大肠杆菌接种于营养琼脂斜面，置于37 ℃恒温箱培养24 h，分别用2 mL 0.5%石炭酸生理盐水清洗，置小圆底试管中，制成浓稠的菌悬液，然后与普通肉汤培养物一起于121.3 ℃下高压处理2 h，破坏其K抗原制成高压抗原，进行O抗原的鉴定。将每个分离菌株的菌悬液与大肠杆菌标准O抗原单因子血清置于洁净的玻板上混匀，1～2 min内出现明显凝集颗粒者为阳性反应，初步筛选可能的O血清型，然后再用试管凝集试验确定O血清型。每次试验同时以高压抗原与0.5%石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。具体判定按照肠道致病性大肠杆菌诊断血清（含15种血清型）使用说明书中标准检测所有细菌分离株的大肠杆菌血清型。

2结果与分析

2.1细菌形态及生长情况

在普通营养琼脂平板上菌落生长良好，湿润，呈现半透明状态，灰白色，边缘光滑；在EMB琼脂培养基平板上形成中等大小、边缘整齐、表面光滑、黑紫色带金属光泽的菌落；在MAC琼脂培养基平板上长出圆形粉红色、表面光滑、圆形、中等大小的菌落；TSI管底及斜面均变为黄色、产气不产H2S；经过革兰氏染色镜检后，镜下均可见大量散在的红色、中等大小、两端钝圆的无芽孢G-短小直杆菌。

2.2分离菌的生化特性

对分离出的60株细菌分别进行生化试验，结果均符合大肠杆菌的生化特性。

鸡大肠杆菌地方分离株的生化试验结果

项目结果MR+VP-乳糖+蔗糖-葡萄糖+麦芽糖+棉子糖-甘露醇+尿素-靛基质﹢H2S﹢赖氨酸﹢鸟氨酸﹢注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.3大肠杆菌致病性试验

接种分离菌的小白鼠12 h后均出现精神不振，18 h开始出现死亡，48 h全部死亡。剖检死亡的小白鼠可见肝脏肿大淤血，表面散在针尖大小的出血点，心包膜、腹膜、肺、肾、脾脏均有不同程度的出血。从死亡小白鼠的肝脏、心脏中均可分离到分离菌。对照组小白鼠健康活泼。分离菌的培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌特性的菌株，即确定为致病性大肠杆菌。

2.4分离菌O血清型鉴定结果

从病鸡、死鸡鸡场中采集的鸡中分别分离出疑似大肠杆菌60株，用大肠杆菌O抗原定型血清对分离的60株大肠杆菌进行O型鉴定。经玻板凝集鉴定，有30株致病性大肠杆菌鉴定出了血清型，其余30株没有定型。30株致病性大肠杆菌血清型O抗原种类及来源分布见表2。其中O55、O111、O78株为优势血清型，共29株，占定型菌株的9667%，分布为O55共5株，O111共9株，O78 共15株，此外还鉴定出了1株O127a血清型。

3结论

本试验分离的60株细菌的革兰氏染色涂片及瑞氏染色涂片中细菌的形态特征皆与鸡大肠杆菌的形态特征一致，60株细菌的生化试验结果一致，且与鸡大肠杆菌的生化特征一

对常德地区分离到的60株鸡致病性大肠杆菌的血清型鉴定结果表明，鸡场中致病性大肠杆菌有30株可量定其血清型，分属4种O抗原血清型，其中O55（5株）占鉴定菌株的16.67%（鸡场1占40%，鸡场2占60%，鸡场3未检测到该血清型菌株），O111（9株）占鉴定菌株的30%（鸡场1占4444%，鸡场2占33.33%，鸡场3占22.22%），O78（15株）占鉴定菌株的50%（鸡场1占46.67%，鸡场2占20.00%，鸡场3占33.33%），此外还分离到1株血清型为O127a（鸡场1占100%，鸡场2和鸡场3均未检测到该血清型菌株）。

有关致病性大肠杆菌血清型鉴定国内外报道较多，各地区流行的优势血清型所占的比例相差比较大，但优势血清型均为O22、O1和O78[2]。本试验所得4个血清型中O78的菌株最多，有15株，占定型菌株的50%，为最主要的优势血清型；另外2种优势血清型（O55和O111）则不在此列。本研究获得的优势血清型种类与国内魏麟等研究报道的湖南西部地区优势血清型种类[3]不同。说明我国鸡大肠杆菌血清型分布存在着复杂性和多样性。此外，在常德地区鸡场1分离到1株O127a血清型的致病性大肠埃希菌，这在其他地区是比较少见的，可能与引种范围比较广有关，因此在大肠杆菌的防治上应引起重视。

目前由于鸡源大肠杆菌不同血清型菌株之间缺乏完全保护，菌株之间的免疫原性也存在差异，而菌株的免疫原性又是由菌体的多种成分决定，因此到目前为止仍未找到一种理想的疫苗能对不同菌株进行免疫保护[4]。对于该病流行的鸡场，采用本地（场）菌株制造的灭活疫苗或用大肠杆菌多价疫苗进行免疫，可以起到较好的效果。从健康高免鸡血清中获得的免疫球蛋白制剂可提高鸡的抗病能力，对鸡有保护作用。

参考文献：

[1]刘观忠，赵超，董修建.“痢得停”对蛋用雏鸡大肠杆菌病的治疗效果及作用机理研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012，上（11）：145-147.

[2]张春荣，苏亚拉图. 我国流行的鸡致病性大肠杆菌血清型[J]. 中国动物检疫，1996，13（1）：2-8.

[3]魏麟，黎晓英，刘胜贵，等. 湖南西部地区鸡大肠杆菌血清型分布及耐药性分析[J]. 安徽农业科学，2009，37（28）：13615-13617.