猪肺源致病性多重耐药大肠杆菌的分离鉴定和药敏分析

朱春玲 ， 刘 丽 ， 刘少龙 ， 刘 欣 ， 王 恒 ， 赵雪芹 ， 赵娅娅 ， 刘双双 ， 夏小静 ， 张守平 ， 罗维玉 ， 徐彦召 ， 杭柏林 ， 孙亚伟 ， 胡建和 ， 王 磊 , 张学明

(1.吉林大学动物医学院 ， 吉林 长春 130000 ； 2.河南科技学院动物科技学院 ， 河南 新乡 453003)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是人和动物的肠道常见致病菌，近年来肠外致病性大肠杆菌的出现引起了学者们的关注，猪源性大肠杆菌也是我国养猪业的一大威胁，其血清型多且复杂，极易产生耐药性，给该菌感染的防治带来困难，并给我国养猪业造成较大经济损失。河南新乡地区某养殖场83例仔猪出现厌食、呼吸困难等症状，并伴随不同程度的腹泻，死亡率为4.5%，为确定该养殖场猪只呼吸系统感染的病原菌，本试验于无菌条件下采集病死仔猪的肺脏，进行病原菌的分离和鉴定，证实病原菌为肠外致病性大肠杆菌，并发现其对临床23种抗菌药物均具有较强耐药性，本试验结果为肠外致病性大肠杆菌的鉴定和临床用药提供了有价值的数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品来源 本试验肺脏采集于河南新乡地区某规模化养殖场。

1.2 主要试剂 LB、伊红美兰和麦康凯培养基、革兰染色试剂盒、DreamTaq Green Master Mix、DNA分子质量标准，均购自北京百泰克生物技术有限公司；细菌药敏试纸盒，购自杭州滨河微生物试剂有限公司；细菌微量生化反应管，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 主要仪器 超净工作台，购自上海志诚科技有限公司；37 ℃恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；恒温摇床，购自北方同正科级技术发展有限公司；PCR仪，购自英国TECHNE公司；JY-300C电泳仪凝胶、凝胶成像系统分析仪，均购自BIO-RAD(美国伯乐)公司。

1.4 方法

1.4.1 病原菌的分离纯化和革兰染色 无菌采取新鲜肺脏病料涂抹于无抗性LB琼脂平板，37 ℃培养12～24 h。挑取单个可疑菌落接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃震荡(200 r/min)培养12 h，重新接种于LB琼脂平板，重复3～4次，获得细菌纯培养物，挑取可疑单个菌落进行革兰染色。

1.4.2 病原菌培养特性观察与生化试验 将纯化后的病原菌接种于LB 琼脂、麦康凯琼脂中，37 ℃培养12 h观察菌落的形态特征及颜色变化。将细菌接种于细菌微量生化反应管中，37 ℃恒温培养72 h，观察试验结果。

1.4.3 病原菌16S rRNA PCR 扩增及测序 采用PCR的方法获得细菌16S rRNA，引物序列为：F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGYTA-CCTTGTTACGACTT-3′，扩增片段大小约为1 495 bp。扩增体系为20 μL：DreamTaq Green Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，病原菌液1 μL，RNase-free H2O 7 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，35个循环；72 ℃再次延伸10 min。扩增完成后取10 μL扩增产物加入1%琼脂糖凝胶进行电泳。将电泳产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI网站BLAST中进行序列比对分析。

1.4.4 药敏试验 分离获得的细菌培养至对数期，细菌浓度约为1×109CFU/mL，抽取1×108CFU均匀涂到LB 琼脂平板上，用无菌镊子夹取药敏片并贴在布满菌液的平板上，将平板倒置于37 ℃培养12～24 h，记录结果。

2 结果

2.1 病原菌菌落形态观察 将该分离菌株分别在LB和麦康凯培养基进行鉴别培养，结果显示，该分离株在LB琼脂平板上呈灰白色、圆形、扁平、光滑、湿润、边缘整齐的菌落(图1A)；在麦康凯培养基上菌落呈粉红色、圆形菌落(图1B)。

图1 分离菌株在不同培养基上的生长情况

2.2 生化试验 采用微量发酵管对分离纯化后的细菌进行生化反应测定，结果显示，该分离菌能够发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖和麦芽糖，不能够发酵阿拉伯糖、山梨醇、邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)、卫矛醇、七叶苷、水杨素、H2S和尿素，与标准大肠杆菌生化反应结果一致。

2.3 PCR扩增与序列比对 采用PCR方法扩增获得分离菌株的16S rRNA片段，并进行凝胶电泳，发现该基因条带大小约为1 500 bp，与预期大小相符合(图2)。将扩增获得的16S rRNA片段进行测序，在NCBI BLAST中进行序列比对，结果显示，该分离菌株与大肠杆菌同源性为99%，判定该分离菌株为大肠杆菌。

图2 分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增

2.4 药敏试验 药敏试验结果(表1)显示，分离菌株对阿米卡星、头孢西叮、头孢他啶和米诺环素敏感；对氨曲南中介；对卡那霉素、头孢噻吩、氨苄西林、氯霉素、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松、环丙沙星、头孢哌酮、青霉素G、哌拉西林、诺氟沙星、庆大霉素、链霉素、妥布霉素、头孢唑林、氧氟沙星、呋喃妥因、四环素、万古霉素、多黏菌素B和左氟沙星23种抗菌药具有较强耐药性；仅对阿米卡星、头孢西叮、头孢他啶和米诺环素具有药物敏感性。

表1 药敏试验结果

3 讨论

随着抗生素的广泛使用，导致目前猪源性大肠杆菌对极大部分抗生素产生了多重且高水平的耐药性，并且催生了不同类型的耐药基因[1-3]。朱力军[4]对20世纪50—90年代初分离保存的大肠杆菌进行了药敏试验，证明了大肠杆菌对抗生素的耐药性呈上升趋势。交叉出现的耐药基因、分离率逐渐增加的超级细菌、耐药性呈上升趋势的多重耐药性菌株均导致猪源性大肠杆菌病愈发严重[4-6]。本试验从河南某猪场分离出的致病性大肠杆菌对卡那霉素、头孢噻吩、氨苄西林、氯霉素、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢曲松等耐受，提示所分离的肺源大肠杆菌为多重耐药性大肠杆菌，能够导致肺脏的肿大、出血和坏死，从而导致猪只死亡。本试验为多重耐药大肠杆菌的鉴定和临床用药提供了参考依据。

目前，肠外致病性大肠杆菌致病研究成为热点，肠外致病性大肠杆菌菌株包含多种基因组和广泛的毒性因子(Virulence factors,VFs)，这些因子共同赋予了菌株在肠外部位定植和侵袭的能力，从而导致尿路感染、脑膜炎、肺炎、骨髓炎和手术部位感染[7]。肺致病性猪大肠杆菌感染屡次出现，Liu等[8]分离获得猪肠外致病性大肠杆菌PCN033株，对其在体内的毒力进行分析，并在基因组方面与人类进行对比，发现PCN033株基因组与人类ExPEC株基因组序列同源性较高。Horn等[9]研究发现，禽致病性大肠杆菌能够引起禽肺内产生局灶性感染，并伴有感染区域的炎症反应和细胞死亡。Stormberg等[10]研究发现，从鸡粪便中分离出的大肠杆菌含有与人肠外致病性大肠杆菌相关的基因，并可在动物模型中引起相应的感染。

肠外致病性大肠杆菌多重耐药性的出现严重威胁着公共卫生安全，增加了人兽共患病的风险。有研究显示，治疗耐药性菌株的成本约为敏感菌株的1.6倍[11]。国内外临床、养殖环境中出现的大肠杆菌耐药性比较严重，甚至南北极也出现耐药的大肠杆菌[12]。本试验中发现，大肠杆菌的耐药性问题严重，在养殖中建议以加强饲养管理为重点，改进饲养环境，以求增强动物的抵抗力，减少患病概率，在必要的情况下给予适量敏感药物治疗，做到多种药物联合、分批使用，拒绝大量、盲目、多次使用同种药物，本试验为指导临床用药以及猪大肠杆菌的耐药性研究提供参考。