牛乳铁蛋白胶体金定量免疫检测试剂卡的研制

井金苗 ， 王 静 ， 魏治静 ， 李亚璞 ， 柳峰松 ， 袁庆彬 ， 薛玉玲 ， 吴 萌

(1. 河北大学生命科学学院 ， 河北 保定 071002 ； 2. 河北省科学院生物研究所 ， 河北 石家庄 050081 ； 3.石家庄君乐宝乳业有限公司 ， 河北 石家庄 050221)

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种非血红素铁结合糖蛋白，主要存在于哺乳动物的乳汁中，分子量约80 kDa，含689个氨基酸，在改善肠胃功能、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒等方面起重要作用，被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域[1-5]。此外，LF还具有增强机体免疫能力和调节机体生理状态平衡的功能，是一种高效营养添加剂，在我国食品安全国家标准《食品营养强化剂使用标准》GB14880—2012中将其列为营养强化剂。目前，牛乳仍是乳制品的主要奶源，因而牛乳铁蛋白(Bovine lactoferrin，BLF)作为一种主要的营养强化剂，在乳制品检测方面对于产品质量保障具有重要意义。

LF的检测方法主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[6]、毛细管电泳法[7]、分光光度法[8]、酶联免疫吸附检测(ELISA)[9]、高效液相色谱(HPLC)[10]、高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)[11-12]、胶体金免疫层析法[13-14]等。从时间、费用、样品处理、准确性等方面对比各个检测方法发现，SDS-PAGE不宜大批量检测；毛细管电泳法与分光光度法对样品要求高，需对样品进行预处理；ELISA干扰因素多；国外检测乳铁蛋白多采用HPLC和HPLC-MS/MS方法[15-16]，这2种方法操作简单，耗时短，耗样量少，准确性高，但设备昂贵且需专业人员操作；胶体金免疫层析法操作简单，成本低廉，灵敏度高，检测快速且准确。本试验利用自主研制的优质BLF单克隆抗体构建胶体金免疫层析定量检测试剂卡，用于检测样品中的BLF，为乳制品中BLF的检测提供一种快捷、准确的定量方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 牛乳铁蛋白(纯度>95%)，购自日本WAKO公司；青链霉素混合液，购自Solarbio公司；弗式完全佐剂(FCA)、弗式不完全佐剂(FIA)、HAT添加剂(HAT supplement)、HT添加剂(HT supplement)、氯金酸、聚乙二醇(PEG)，均购自Sigma公司；胎牛血清，购自BI公司；牛血清白蛋白，购自Roche公司；DMEM细胞培养基(粉末型)，购自Gibco公司；HEPES，购自Amersco公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CN95硝酸纤维素(NC)膜，购自Sartorius公司；玻璃纤维素膜，购自上海杰一生物技术有限公司；聚氯乙烯(PVC)底板、吸水纸，均购自上海金标生物科技有限公司；Tween-20、碳酸钠、浓硫酸、柠檬酸三钠、碳酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等，均为国产分析纯；牛奶样本采自河北省行唐县畜产品质量检测站；SP2/0骨髓瘤细胞由河北省科学院生物研究所保存。

1.2 主要仪器 超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；CO2培养箱，SANYO公司产品；恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；细胞培养板和细胞培养瓶，均为Eppendorf公司产品；三维平面划膜喷金仪和微电脑自动斩切机，均为上海金标公司产品；高效液相色谱仪，美国Agilent公司产品；胶体金读数仪，河北森越生物科技有限公司产品。

1.3 实验动物 BLAB/c小鼠，雌性，6～8周龄，购自河北省实验动物中心。

1.4 BLF单克隆抗体的制备

1.4.1 免疫小鼠 选3只6～8周龄的BLAB/c小鼠作为实验动物，抗原为牛乳铁蛋白。用无菌生理盐水溶解抗原后与等体积的弗式佐剂混合并充分震荡乳化，对小鼠进行皮下多点注射，每只小鼠注射抗原50 μg，共免疫3～4次，每次间隔2周。第1次免疫用弗式完全佐剂，第2～4次免疫用弗式不完全佐剂，在第3次免疫1周后取眼球血检测效价，选择效价最高的小鼠进行细胞融合，并在细胞融合前3天腹腔注射50 μg抗原加强免疫。

1.4.2 细胞融合 采用PEG法进行细胞融合，在细胞融合前1周复苏SP2/0骨髓瘤细胞，使细胞处于对数生长期。颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用DMEM培养液吹出脾细胞，将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以10∶1的比例混合，1 min内逐滴加入800 μL PEG融合剂，使PEG与细胞充分接触完成融合，之后用HAT选择培养基培养细胞。

1.4.3 筛选阳性杂交瘤细胞 采用间接ELISA检测筛选阳性杂交瘤细胞，以免疫小鼠眼球血清为阳性对照，正常小鼠眼球血清为阴性对照，不含小鼠血清的洗涤液(含有0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液，PBST)为空白对照，筛选出检测结果为阳性的杂交瘤细胞团，用有限稀释法进行亚克隆，筛选出单一的能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

1.4.4 获取单克隆抗体 扩大培养筛选出的阳性杂交瘤细胞，采用小鼠体内诱生法获得腹水，用辛酸硫酸铵沉淀法纯化腹水获得2株单克隆抗体2B11和2E2。

1.5 BLF单克隆抗体的鉴定 采用常规SDS-PAGE鉴定抗体纯化效果并用间接ELISA检测1 μg单克隆抗体的效价。

1.6 胶体金定量检测试剂卡的制备

1.6.1 胶体金的制备 将100 mL超纯水置于磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，加入1 mL 1%氯金酸溶液，待溶液煮沸后再加入1 mL 1%柠檬酸三钠，继续加热搅拌15 min后停止加热，冷却至室温后定容至100 mL。

1.6.2 最适标记pH的确定 取1 mL烧制好的胶体金溶液分别加入至4个1.5 mL离心管中，然后分别加入0.1 mol/L K2CO3溶液调节pH至4.0、5.5、7.0和8.5，混匀后向其中分别加入5 μg乳铁蛋白抗体2B11反应30 min，再逐滴加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液50 μL，30 min后离心弃上清，复溶液重悬，冷藏避光保存。

1.6.3 最适标记抗体投料量的确定 取1 mL胶体金溶液分别加入至4个1.5 mL离心管中，加入0.1 mol/L K2CO3溶液调节pH至5.5，充分混匀之后，分别加入1、3、5 μg和10 μg乳铁蛋白抗体反应30 min。然后向上述溶液中逐滴加入10% BSA溶液50 μL，30 min后离心弃上清，复溶液重悬，冷藏避光保存。

1.6.4 抗体包被 将牛乳铁蛋白2E2抗体作为检测线(T线)，以1 mg/mL浓度包被到NC膜上，质控线(C线)用兔抗鼠IgG，包被浓度为1 mg/mL。

1.6.5 胶体金定量检测试剂卡的组装 首先将NC膜粘贴在PVC底板上，在NC膜的C线和T线上分别包被对应抗体，于60 ℃干燥4 h；将胶体金标记BLF单克隆抗体2B11按4 μL/cm喷涂于玻璃纤维素膜上，37 ℃过夜干燥，作为结合垫；在NC膜靠近C线一端粘接吸水纸，在靠近T线一端依次粘接结合垫、样品垫，并切成3 mm宽的胶体金定量检测试剂卡，装入卡壳，干燥密封备用。

1.6.6 检测条件的确定 准备检测试纸，分别在50、70、90 μL和110 μL加样量条件下，向加样孔中加入400 ng/mL抗原反应，并根据试验结果确定合适加样量；分别在反应5、10 min和15 min时检测，以确定最佳反应时间。

1.6.7 标准曲线的制作 将BLF用高效液相色谱法进行测定标化，配制50、125、250、500 μg/mL和1 000 μg/mL的标准品溶液，将标准品溶液分别稀释5 000倍用胶体金定量检测试剂卡进行检测，得到灰度值并绘制产品标准曲线。

1.7 胶体金定量检测试剂卡的性能测试

1.7.1 空白限 取不含BLF的样本稀释液作为0 μg/mL样本，使用试剂卡重复测试该样本20次，计算检测信号的平均值(AV)及标准差(SD)，并计算出AV+2SD的数值，将该数值带入定标曲线得到空白限。

1.7.2 重复性 分别取浓度为50、125 μg/mL和1 000 μg/mL的3支标准品进行检测，每个浓度重复检测10次，并根据检测结果计算CV值。

1.7.3 线性 分别取50、125、250、500 μg/mL和1 000 μg/mL样本进行检测，每个浓度平行检测3次，取测得浓度的平均值与理论浓度值进行直线拟合并计算其线性回归相关系数R。

1.7.4 牛奶样本检测 取10份牛奶样本，分别用胶体金免疫层析检测法和高效液相色谱法进行检测，以高效液相色谱法的检测结果为横坐标，以胶体金免疫层析检测法的检测结果为纵坐标，进行直线拟合，计算得到线性相关系数R。

1.7.5 特异性 将α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别用样本稀释液配制成1 000 ng/mL溶液，使用研制的胶体金定量检测试剂卡分别对2种蛋白重复检测3次，评估其交叉反应。

2 结果

2.1 BLF免疫小鼠效价检测 用免疫原BLF免疫BLAB/c小鼠后采用间接ELISA检测抗体效价，3只小鼠的效价均达到2.48×105以上，挑选效价最高的小鼠进行后续试验。

2.2 BLF单克隆抗体的鉴定

2.2.1 纯度鉴定 经SDS-PAGE电泳检测(图1)，BLF单抗(IgG)均在相对分子质量50 kDa和25 kDa附近出现明显的条带，分别对应抗体的重链和轻链，纯度良好。

图1 纯化BLF单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定

2.2.2 效价鉴定 取BLF单抗2B11和2E2各1 μg，通过间接ELISA检测效价，且采用每个稀释倍数重复检测1次的方法，检测结果计算AV及SD，如图2所示，1 μg的BLF单抗2B11和2E2效价分别达到6.5×106和3.2×106。

图2 BLF单克隆抗体的效价分析

2.3 胶体金定量检测试剂卡的研制

2.3.1 最适标记pH的确定 将制备的金标抗体分别点涂至未喷金的胶体金定量检测试剂卡结合垫上，各组均检测0、10、100 ng/mL和1 000 ng/mL抗原，每个浓度检测3次，计算检测结果的AV及SD。

在pH为4.0时，检测0 ng/mL样本的灰度值大于0，出现假阳性；在pH为5.5、7.0和8.5时，检测0 ng/mL样本的灰度值均为0，在这3个pH条件下，pH为5.5时检测灵敏度高，线性梯度好，所以根据检测结果确定最适标记pH为5.5(图3)。

图3 BLF胶体金定量检测试剂卡最适pH的筛选

2.3.2 最适蛋白标记量的确定 将制备的金标抗体分别点涂至未喷金的胶体金定量检测试剂卡结合垫上，各组均检测0、10、100 ng/mL和1 000 ng/mL抗原，每个浓度检测3次，计算检测结果的AV和SD。检测结果见图4，在抗体标记量为1 μg/mL时，检测数值偏低，灵敏度低；在抗体标记量为3 μg/mL时，线性及灵敏度偏低；在抗体标记量为5 μg/mL和10 μg/mL时，线性及灵敏度都很高，检测数值无明显差异，为避免原料的浪费，确定抗体的标记量为5 μg/mL。

图4 BLF胶体金定量检测试剂卡蛋白标记量的筛选

2.3.3 检测条件的确定 由图5 A可知，上样量90 μL和110 μL结合垫有残留，故加样量50～70 μL最合适；反应时间5 min(图5B)和10 min(图5C)时NC膜上有红色颜色残留，反应时间15 min(图5D)背景最干净，无红色颜色残留。因此，试验操作加样量选择60 μL，反应时间为15 min。

图5 BLF胶体金定量检测试剂卡加样量及检测时间的筛选

图6 BLF胶体金定量检测试剂卡标准曲线

2.4 性能测试

2.4.1 空白限 计算重复检测20次0 μg/mL样本的信号值AV+2SD结果为29.88。将该结果代入标准曲线方程，可计算得到空白限为21.86 μg/mL。

2.4.2 重复性 根据检测结果(表1)计算3支不同浓度的标准品的CV值，结果均小于13%，表明BLF胶体金定量检测试剂卡重复性良好。

表1 BLF胶体金定量检测试剂卡的重复性

2.4.3 线性 通过对样本进行各点重复3次检测，计算得到y=1.179 8x-25.661，其线性相关系数为R=0.997 7，表明BLF胶体金定量检测试剂卡具有良好的线性。

2.4.4 牛奶样本检测 对比胶体金法和用高效液相色谱法的牛奶样本检测结果，计算得相关系数R=0.988 5(图7)，表明二者检测结果的相关性较好。

图7 BLF胶体金免疫层析法与液相色谱法检测样本的相关性

2.4.5 特异性 将α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作为样品分别滴加到胶体金定量检测试剂卡中，检测值均为0(表2)，即BLF胶体金定量检测试剂卡与二者不存在交叉反应，而仅针对BLF具有良好的特异性反应。

表2 BLF胶体金定量检测试剂卡的特异性

3 讨论

在我国，胶体金免疫层析技术最开始是测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)，之后在早孕、毒品、疾病[17-18]、食品的检测方面得到广泛的应用。目前在食品检测方面，其可以对三聚氰胺[19-20]、致病菌污染[21]、抗生素[22-23]、农药残留[24]、重金属[25-26]、致癌物[27]等快速检测。本试验以牛乳铁蛋白(BLF)为免疫原制备了2株抗BLF的杂交瘤细胞株2B11和2E2，采用小鼠体内诱生法制备单克隆抗体，单抗经辛酸硫酸铵沉淀法纯化，经检测2个单抗纯度好且效价高。基于BLF单抗建立快速检测BLF的胶体金定量检测试剂卡检测方法，经过优化，胶体金定量检测试剂卡的重复性和线性良好且特异性强，可用于乳及乳制品中BLF的快速检测。

目前市场中的乳制品检测多为高效液相色谱法，其准确性高，但需要昂贵的仪器设备和专业人员，而以免疫层析法为基础研制的胶体金检测试剂卡操作简单，价格低廉，与高效液相色谱法的样本检测结果的相关系数达到0.988 5，为检测样品中的BLF提供了一种快速、灵敏、简便的定量检测方法。但本方法目前检测的样本量有限，其准确度等性能有待进一步评估。

随着生活物质资源的日趋丰富，市场上的动物乳制品已不仅局限于牛奶，据报道羊奶及牦牛奶各有优点[12]。针对不同动物来源乳制品中的乳铁蛋白含量检测产品的开发，将是未来需要补充的空白[28]。本课题组接下来可以在现有的技术平台基础上，很快研发出针对不同来源乳制品中乳铁蛋白含量的一系列快速检测产品。