Xpert MTB/RIF对结核菌利福平耐药的诊断价值及rpoB基因突变特点的分析

高春景 杨洋 阚宗卫 成松 魏素梅 胡凯

目前，耐多药结核病(Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和利福平耐药结核病(Rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)仍然是全球结核病控制工作所面临的严峻问题。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估算，2018年全球新增约50万利福平耐药结核病病例，估算其中中国新增利福平耐药结核6.6万例，我国也是MDR-TB和RR-TB 30个高负担国家之一，MDR-TB和RR-TB的疫情非常严重[1]，因此利福平(Rifampicin,RIF)耐药的早期诊断尤其重要。Xpert MTB/RIF检测是一种自动半巢式实时PCR系统，使用覆盖rpoB基因RRDR核心区的五个重叠的分子信标探针来实现结核病和利福平耐药的检测，约2h可以得到结果[2]。2014年WHO推荐该技术用于多种结核病的诊断及利福平耐药检测[3]。本研究旨在分析Xpert MTB/RIF检测对利福平耐药的诊断价值及rpoB基因的突变特点，现汇报如下。

资料与方法

一、研究对象

回顾性纳入2016年1月至2020年6月期间来院就诊患者相同标本同时进行了结核分枝杆菌培养及药敏试验和Xpert MTB/RIF检测，且任一种方法检出MTB。

二、研究方法

1.结核分枝杆菌培养及药敏试验：采用改良罗氏培养基分枝杆菌培养并行菌种鉴定及比例法药物敏感试验(培养药敏)，具体步骤按照《手册》[4]进行。

2.Xpert MTB/RIF检测：具体操作步骤按照Cepheid公司的Gene Xpert仪器说明书[5]进行。结果判读：①5条探针结合的是野生型结核分枝杆菌，至少两条探针结合到标本提取出的DNA上，就表示检测到结核分枝杆菌，MTB这一项检测结果就会报告阳性；②A-E探针有1条或者多条探针阴性，即该探针没有结合到患者样本DNA上进行扩增，则代表患者样本中的结核分枝杆菌的探针相对应的rpoB基因片段有发生突变，阻止利福平对结核分枝杆菌起作用，即对利福平产生了耐药结果；③当5条探针均结合到患者样本DNA上，扩增，均为阳性时，代表MTB检出，同时对利福平敏感。

3.治疗史：根据中华人民共和国卫生行业标准WS 196-2017[6]分为初治和复治。

4. 统计方法:根据SPSS 20.0统计软件进行分析,计数资料采用率表示,组间采用χ2检验及Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义；两种检验方法的一致率=(观察符合例数/观察总例数)×100%；两种检验方法的一致性采用Kappa检验。

结 果

一、收集2016年1月至2020年6月期间来院就诊患者相同标本同时进行了培养药敏和Xpert MTB/RIF检测共7659例, Xpert MTB/RIF法检出MTB 4236例，培养法检出MTB 3752例；两种方法检测MTB的结果对比分析(见表1)。两种方法同时检出MTB共3621例：培养药敏法检出利福平耐药238例，Xpert MTB/RIF法检出利福平耐药262例；两种方法检出利福平耐药的结果对比分析(见表2)。

表1 Xpert MTB/RIF法与培养法检测MTB结果的比较

通过配对χ2检验，两种方法差异有统计学意义(P<0.05), Xpert MTB/RIF检测的阳性检出率高。

表2 Xpert MTB/RIF法与培养药敏法利福平耐药结果的比较

两种检验方法的一致率为99.01%；采用Kappa 检验，K值=0.92，两种方法的检测结果完全符合，一致性很好。

二、Xpert法检出利福平耐药262例，其中男性190例，年龄16～83岁，中位数34.5岁；女性72例，年龄14～82岁，中位数28.5岁。其中有19例未发现A-E探针突变，但结果示利福平耐药；243例发现探针突变，探针突变的发生率分别为E探针63.37%(154/243)、D探针20.16%(49/243)、B探针8.23%(20/243)、A探针4.53%(11/243)、C探针0.82%(2/243)、联合探针突变2.88%(7/243)；7例联合探针突变分别为BE、CE、AB、AD、ACE各1例及2例DE。Xpert法利福平耐药探针突变与培养药敏法利福平耐药的结果对比分析(见表2)。

三、243例存在探针突变的RR-TB病例中，初治为65.02%(158/243)，复治为34.98%(85/243)；初治RR-TB病例中，探针突变的发生率分别为E探针61.39%(97/158)、D探针21.52%(34/158)、B探针8.23%(13/158)、A探针5.70%(9/158)、C探针0.63%(1/158)、联合探针突变2.53%(4/158)；复治RR-TB病例中，探针突变的发生率分别为E探针67.06%(57/85)、D探针17.65%(15/85)、B探针8.24%(7/85)、A探针2.35%(2/85)、C探针1.18% (1/85)、联合探针突变3.53%(3/85)；初治4例联合探针突变分别为ACE、DE、BE、CE,复治3例联合探针突变分别为AD、AB、DE；RR-TB不同探针突变特点与治疗史的关联性分析(见表3、4)。

表3 Xpert探针突变与培养药敏法利福平耐药结果的对比

以培养药敏结果为利福平耐药的金标准，两组比较，χ2=34.26，P<0.01,差异有显著统计学意义，Xpert无探针突变组利福平耐药的准确性要显著低于有探针突变组。

表4 不同探针突变特点与治疗史的关联性分析

两组间比较采用Fisher确切概率法，P<0.01,初治与复治组不同探针突变比较有显著统计学差异。

四、Xpert MTB/RIF检测不同样品探针的曲线是不同的，与样品中结核菌的DNA模板起始浓度有关。Gene Xpert仪器显示的不同探针突变的代表性曲线(见图1-6)。

讨 论

目前耐多药结核病正在成为全球性的威胁，WHO报道利福平耐药结核中78%为耐多药结核[1]，WHO《耐药结核病治疗指南》[7]中推荐RR-TB及MDR-TB的化疗方案是一样的，因此早期诊断利福平是否耐药对结核病治疗方案的制定尤为重要。Xpert MTB/RIF检测作为一种能同时对结核病诊断及利福平耐药检测的快速简便的方法,在临床上得到了广泛的应用。国内外许多研究[8-10]显示Xpert MTB/RIF检测对结核病的诊断有很高的敏感度和特异度。本研究未再对Xpert MTB/RIF检测对结核病的诊断的敏感度和特异度进行分析，但是在7659例标本中Xpert MTB/RIF的阳性检出率要高

图1 C探针突变的曲线

1.无探针突变的曲线；2.A探针突变的曲线；3.B探针突变的曲线；4.C探针突变的曲线；5.D探针突变的曲线；6.E探针突变的曲线

于培养，且有统计学意义，这与王启明等[11]的研究不一致，这可能与本研究的培养方法为改良罗氏培养法，而王启明等的研究采用的液体培养法有关，因为液体培养的阳性率要高于改良罗氏培养法。本研究显示Xpert MTB/RIF检测利福平耐药与培养药敏的一致率达到99.01%，采用Kappa 检验，两种方法的检测结果完全符合，而且Xpert MTB/RIF检测用时较短，一般仅需2h左右，因此Xpert MTB/RIF可以快速有效的诊断利福平耐药结核，对方案的早期制定有重要价值。

Xpert MTB/RIF检测和培养药敏检测利福平耐药结果亦存在不一致的情况，本研究有6例Xpert利福平敏感而培养药敏示利福平耐药，这是因为Xpert MTB/RIF检测仅仅覆盖了rpoB基因RRDR核心区，而Musser等报道[12]只有95%利福平耐药突变位于rpoB序列中RRDR核心区。本研究有30例Xpert利福平耐药而培养药敏示利福平敏感，胡族琼等[13]研究发现rpoB有8种无意义的错义突变存在于4 株利福平敏感株中,认为这种无意义的突变,将导致利用分子诊断技术检测利福平耐药出现假阳性的可能；而Noura等[14]及Singhal等[15]研究发现rpoB 81bp核心区的L511P、D516Y、H526N、H526L、H526S和L533P等突变可能提示利福平耐药，而培养药敏结果是利福平敏感的，通过检查耐多药结核菌株的利福平耐药基因型，以便对患者进行最佳治疗是有必要的。

Xpert MTB/RIF检测是通过覆盖rpoB基因RRDR核心区A-E五条探针是否突变来实现利福平耐药的检测的，五条探针覆盖的密码子分别为：A(密码子507-511)，B(密码子512-518)，C(密码子518-523)，D(密码子523-529)和E(密码子529-533)[2]。本研究显示利福平耐药结核探针突变发生的频率为E>D>B>A>联合探针>C，其中E探针突变率最高达到63.37%，其次是D探针20.16%、B探针8.23%，而C探针突变最少。Zaw等的一篇综述分析显示rpoB基因的RRDR中最常见的突变密码子是531、526和516[16],而三个密码子分别位于E、D、B三个探针的覆盖区，本研究显示E、D、B三条探针突变频率与531、526和516密码子突变频率是一致的，三条探针的总突变率占91.76%。本研究显示利福平耐药结核不管是初治还是复治A-E五条探针突变的频率大小顺序是一致的，均为E>D>B>A>C。但两组比较，探针突变的频率有统计学差异，A、D探针突变初治组要高于复治组，E探针突变初治组要低于复治组，B探针突变两组频率基本一致，C探针两组各一例，联合探针突变初治组低于复治组，初治组的4例联合探针突变均含有E探针突变，而复治3例联合探针突变仅有1例合并E探针突变；而Uddin等的研究显示初治患者只有E探针突变，且联合探针突变仅见于复治患者[17]，这可能与不同国家和地区耐药的原因有一定关系，本研究显示本院原发耐药占65.02%，原发感染占比较高，进一步表明早期发现并治疗耐药结核，控制传染源，有助于本地区控制耐药结核病疫情的传播。

本研究显示XpertXpert MTB/RIF法检出利福平耐药的262例中存在有19例未发现A-E探针突变，但结果示利福平耐药,这种结果是存在的，其原因是：机器判读结果除了根据探针是否结合，有没有突变存在之外,也会判读Ct值最高的一条探针和Ct值最低的一条探针之间的差值，如果差值>4.0，则认为浓度差异明显，有一条探针存在突变可能，就会报告利福平耐药的结果[2]。但本研究显示19例未发现探针突变，而结果示利福平耐药病例中，有10例培养药敏结果为利福平敏感，如果以培养药敏结果为利福平耐药的金标准， Xpert无探针突变组利福平耐药的准确性要明显低于有探针突变组。由于本研究为回顾性研究，19例病例未进行复检，也未进行其它分子生物学检测，是否存在利福平耐药基因突变不得而知，需要进一步的研究。

总之，本研究结果显示利福平耐药结核探针突变主要发生在E探针和D探针，C探针突变最少。利福平原发耐药比例较高，Xpert MTB/RIF检测可以快速有效的诊断利福平耐药结核，有助于早发现、早治疗，有利于阻止耐药结核病的传播，减少原发感染的可能。