抗菌型苯丙氨酸基聚酯脲静电纺复合纳米纤维敷料的制备及性能

2022-05-13李梦娜王学利李发学吴德群

东华大学学报（自然科学版） 2022年2期

李梦娜，王学利，李发学,，吴德群,

(东华大学 a.纺织学院，b.纺织科技创新中心，上海 201620)

随着糖尿病、癌症等疾病发病率的逐年上升，皮肤伤口敷料已经成为创面护理的重要组成部分[1]。静电纺纳米纤维膜具有与细胞外基质相似的结构，能够促进创面处细胞之间的相互作用，是一种理想的伤口敷料[2-3]，其具有比表面积大、柔韧性强、孔隙率高等优点，可以作为药物的载体向伤口递送药物，在开发功能性敷料方面具有很大的潜力[4]。目前，抗菌型静电纺纳米纤维敷料引起了人们的关注。

姜黄素(curcumin，Cur)是一种天然的抗菌剂，已被广泛用于多种类型伤口的愈合[5-6]。将Cur载入静电纺纳米纤维敷料中，并控制其局部释放，可以改善Cur溶解度差、体内稳定性低等缺点[7]。聚己内酯(polycaprolactone，PCL)是静电纺纳米纤维膜中最常用的可生物降解聚合物，但是在使用负载Cur的PCL静电纺纳米纤维膜过程中发现，这种静电纺纳米纤维膜的力学性能差、结构稳定性低[8-9]。

苯丙氨酸基聚酯脲(phenylalanine-based poly(ester urea)s，PBP)的分子结构中含有大量的脲基，分子链和分子间存在大量的氢键能够为聚合物提供优异的力学性能、热稳定性和耐化学腐蚀性[10]。此外，PBP还能够满足各种伤口修复的需求，其应用范围主要为药物输送、骨肌腱修复、血管组织再生等[11]。

将PBP和PCL结合在一起制备静电纺复合纳米纤维膜，以增强PCL静电纺纳米纤维膜的力学性能，提高其细胞相容性。在静电纺丝液中加入的Cur赋予了静电纺纳米纤维良好的抗菌性能。因此负载Cur的PBP静电纺复合纳米纤维膜有望应用于感染性伤口的修复。

1 试验部分

1.1 试验原料与仪器

试验原料：1,4-丁二醇、1,4-丁二胺(BDA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、六氟异丙醇(HFIP)、甲苯、乙酸乙酯，均为化学纯，国药化学试剂有限公司；对甲苯磺酸一水合物(TsOH·H2O)、L-苯丙氨酸(Phe)、辛酸亚锡(Sn(Oct)2)、三乙胺(TEA)、六亚甲基二异氰酸酯(HDI)，均为分析纯，阿拉丁试剂有限公司；PCL(分子量约80 000 g/mol)，济南岱钢有限公司；Cur，化学纯，上海凌峰化学试剂有限公司。

试验仪器：ME104 T/02型分析天平、MYP19-2型磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器公司；LSP02-2B型静电纺丝机，保定兰格有限公司；SN210C型压力蒸汽灭菌器，上海尔迪有限公司；BPN-80CH型二氧化碳细胞培养箱，上海一恒有限公司；Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、Avance 400型核磁共振波谱仪(NMR)，瑞士Bruker公司；JSM-5600LV型扫描电子显微镜(SEM)，日本JEOL公司。

1.2 PBP的制备与表征

1.2.1 PB的制备

参照文献[12]合成二胺二苯丙氨酸单体(PB)，合成路线如图1所示。将9.1 g的1,4-丁二醇、35.0 g的Phe以及44.4 g的TsOH·H2O装入含有650 mL甲苯的两口烧瓶中。将烧瓶固定在单层玻璃反应釜中，待烧瓶中混合物在反应温度为120 ℃时进行回流搅拌，持续反应16 h。反应停止后，待混合物溶液冷却至室温，过滤出溶液中的白色沉淀物。将沉淀物在500 mL的沸水中溶解，形成的溶液于室温下静置12 h。过滤出下层析出的固体，将其置于50 ℃的真空烘箱中干燥8 h，最终形成PB。

图1 PB的合成路线Fig.1 Synthetic route of PB

1.2.2 PBP的制备

利用PB、BDA和HDI反应制备PBP，合成路线如图2所示。将5.8 g的PB加入装有20 mL经减压蒸馏除水的NMP的烧瓶中，将烧瓶固定在油浴锅中，在温度60 ℃下搅拌，使PB充分溶解。待PB溶液澄清后，再加入2.0 g除水的TEA，搅拌反应30 min。待油浴锅温度升高到70 ℃后，向烧瓶中加入Sn(Oct)2(质量分数为0.2%)作为催化剂。过一段时间后，使用恒压分液漏斗将1.7 g的HDI(溶于5 mL NMP)逐滴滴加到含催化剂的PB溶液中进行预聚合反应，形成PBP的预聚物溶液。待聚合反应2 h后，将油浴锅温度升高至75 ℃，再向预聚物溶液里加入0.7 g的BDA(溶于5 mL NMP)继续反应6 h，得到含PBP的黄色溶液，然后使该溶液在冷的乙酸乙酯中沉淀出产物PBP混合物，并在4 ℃冰箱里静置过夜。最后过滤出PBP，将其置于50 ℃的真空烘箱中干燥8 h。

图2 PBP的合成路线Fig.2 Synthetic route of PBP

1.2.3 PB和PBP的表征

PB和PBP的化学结构通过核磁共振氢谱(1H NMR)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行表征：NMR测试中，将5 mg的PB和PBP样品分别溶解在1 mL的氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)中，进行氢谱扫描；FTIR谱测试中，样品扫描的波长范围为500～4 000 cm。

1.3 静电纺纳米纤维膜的制备与表征

1.3.1 静电纺纳米纤维膜的制备

先用磁力搅拌器将PBP和PCL(质量比为2∶1)溶解在HFIP中形成质量分数为15%的混合溶液。再向混合溶液中加入质量分数为10%的Cur，将混合物在室温下搅拌以获得均匀的纺丝液。将制备的纺丝液转移到装配有23 G金属针头体积为20 mL的注射器里进行静电纺丝,制备PBP/PCL/Cur纳米纤维膜。纺丝温度为25 ℃、相对湿度为45%，纺丝电压为15 kV，接收距离为15 cm，流速为1 mL/h。制备好的PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜在真空干燥箱内干燥8 h除去残留的溶剂。采用同样的方法，制备了PCL和没有添加Cur的PBP/PCL静电纺纳米纤维膜。

1.3.2 静电纺纳米纤维膜的表征

利用FTIR对PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜上的官能团进行表征，采用SEM对其外观形貌进行表征。从每张SEM图片中随机选取100根纤维，用ImageJ软件测量静电纺纳米纤维膜中纤维的平均直径。

1.3.3 静电纺纳米纤维膜的力学性能的测定

采用万能材料试验机测试静电纺纳米纤维膜的力学性能。将 PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜裁剪成矩形条(50 mm×10 mm)，然后将这些矩形条的两端分别固定于万能材料试验机的两个夹头上，夹头的拉伸速度设置为 5 mm/min，启动仪器以拉伸纤维膜直至断裂，重复3次测试，求平均值。

1.3.4 Cur的释放性能测定

将直径为8 mm的PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜放入离心管中，向离心管中加入5 mL磷酸缓冲盐(PBS)溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)，将离心管放入恒温振荡水浴锅中。每隔1 h，从离心管中取出100 μL PBS溶液，使用紫外分光光度计在波长为535 nm处测量溶液的光密度。借助Cur的标准图表，根据光密度值计算从PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜中释放出的Cur量[13]。

1.3.5 PBP/PCL和PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的抗菌性能表征

通过数菌落法和平板扩散法来表征PBP/PCL和PBP/PCL/Cur两种静电纺纳米纤维膜的抗菌性能。首先，将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌分别放在含有肉汤的玻璃瓶中，将玻璃瓶在空气摇床中培养24 h。利用平板扩散法进行计数测试，取出1 mL细菌悬浮液(浓度1×106CFU/mL)均匀涂抹在10 mL凝固的琼脂上面。其次，将直径为8 mm的PBP/PCL和PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜轻轻黏附在琼脂板的中间，置于细菌生化培养箱中培养24 h。最后，拍照记录静电纺纳米纤维膜的抑菌圈。静电纺纳米纤维膜的抑菌圈直径的计算如式(1)所示。

(1)

式中：D为抑制区的直径，mm；d为静电纺纳米纤维膜的直径，mm。

平板计数法测试中，分别将15 mg的PBP/PCL、PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜放在5 mL含细菌(金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌)的PBS溶液中，在37℃的空气摇床中培养12 h。取1 mL的细菌悬浮液涂抹在10 mL凝固的营养琼脂上，再次培养24 h。取未经静电纺纳米纤维膜处理的琼脂板作为对照组。计算出每组样品中细菌的菌落数，静电纺纳米纤维膜的抑菌率计算如式(2)所示。

(2)

式中：A为对照组中细菌的菌落数；B为试验组中细菌的菌落数。

1.3.6 PBP/PCL和PBP/PCL/Cur 静电纺纳米纤维膜的细胞相容性的表征

采用MTS法和细胞活死染色分析法来评估PBP/PCL和PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜对L929成纤维细胞的毒性。将两种静电纺纳米纤维膜剪切成直径为8 mm的圆形，分别放在24孔的孔板里。PBP/PCL 和PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜用PBS溶液冲洗3次后，依次在体积分数为75%的乙醇、高糖培养基浸泡30 min。将1 mL 培养基(含3×104个细胞)加入到每个孔中，在细胞培养箱中培养(温度为37 ℃，CO2体积分数为5%)，培养基每隔24 h更换一次。

根据文献[14]进行MTS测试，细胞在培养24、48、72 h后，弃去孔板中的培养基，向孔板中加入500 μL MTS工作液或培养基。再次培养4 h后，从每组样品中取出150 μL液体，用酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光度(C试验)。其中只含培养基不含细胞组作为空白组的吸光度(C空白)，不含静电纺纳米纤维膜只含细胞组作为对照组的吸光度(C对照)。静电纺纳米纤维膜上细胞存活率的计算如式(3)所示。

(3)

细胞活死染色测试中，用PI和Calcein-AM染料对静电纺纳米纤维膜上的细胞进行染色，用激光扫描共聚焦显微镜采集细胞荧光图片。

2 结果与讨论

2.1 PB和PBP的表征

图3 PB和PBP的核磁图谱和红外光谱图Fig.3 1H NMR and FTIR spectra of PB and PBP

2.2 不同静电纺纳米纤维膜的表征

图4 反应物和不同静电纺纳米纤维膜的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of reactants and different electrospun nanofiber mats

不同静电纺纳米纤维膜的形貌图以及纤维的直径分布图如图5所示。由图5可知，PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的表面均光滑且平整，纤维随机排列构成多孔的三维结构，并未见到明显的纤维团聚现象。从PCL、PBP/PCL、PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的纤维直径分布图可以看出，其直径均是正态分布。PCL静电纺纳米纤维膜中纤维的平均直径为(434±95)nm，PBP/PCL静电纺纳米纤维膜中纤维的直径比PCL静电纺纳米纤维膜略有缩小，其平均直径为(375±159)nm。PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜中纤维的直径与PBP/PCL静电纺纳米纤维膜中纤维的直径相比略微增加，其平均直径为(407±168)nm。

图5 不同静电纺纳米纤维膜的SEM图和纤维直径分布Fig.5 SEM images and diameter distribution of different electrospun nanofiber mats

2.3 不同静电纺纳米纤维膜的力学性能的测定

不同静电纺纳米纤维膜的应力-应变曲线如图6所示。由图6可知，PCL静电纺纳米纤维膜的拉伸断裂强度为(1.15±0.23)MPa，断裂伸长率为(79.81±3.40)%，PBP/PCL静电纺纳米纤维膜的拉伸断裂强度为(2.14±0.36)MPa，断裂伸长率为(108.34±5.10)%。由于PBP中含有大量的脲键和氢键，具有很好的稳定性，因此PBP和PCL混纺后制备的静电纺纳米纤维膜的力学性能显著提高。PBP/PCL静电纺纳米纤维膜在负载Cur后力学性能并未受到影响，断裂强度和断裂伸长率稍微增加。PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的拉伸断裂强度为(2.37±0.18)MPa，断裂伸长率为(117.45±4.50)%。

图6 不同静电纺纳米纤维膜的应力-应变曲线Fig.6 The stress-strain curves of different electrospun nanofiber mats

2.4 Cur的释放性能测定

PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜利用Cur来达到抗菌目的，因此测试了PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜释放Cur的性能。PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的Cur释放曲线如图7所示。由图7可知，PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜可以在72 h内持续稳定地释放Cur。文献[19]研究表明，含有Cur的PCL静电纺纳米纤维膜的Cur释放曲线在初始阶段会显示出爆发释放的趋势。相比而言，PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜却不会出现这一情况，其在初始的12 h内可以快速并且平稳地释放Cur，Cur的累计释放率达到49.9%，在随后的60 h内仍可以稳定地释放Cur。文献[20]制备的负载Cur的PCL/壳聚糖静电纺纳米纤维膜在16 d内Cur的累计释放率为75%，而PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的Cur释放率更高，在72 h内Cur的累计释放率可达85.1%。这一高效释放Cur的特征能够以极大限度发挥抗菌功效，更有利于感染性伤口的愈合。

图7 Cur的释放曲线图Fig.7 The release curve of Cur

2.5 不同静电纺纳米纤维膜的抗菌性能

由于PCL静电纺纳米纤维膜没有抗菌性能[19]，因此测试PBP/PCL和PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的抗菌性能，其结果如图8所示。由图8可知，经PBP/PCL静电纺纳米纤维膜处理的琼脂板表面附着大量细菌，而经PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜处理的琼脂表面细菌明显减少。通过式(2)计算，PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别为(93.3±1.3)%、(94.5±2.1)%。平板扩散法的测试结果显示：在PBP/PCL静电纺纳米纤维膜处理的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的琼脂板上均未观察到抑菌圈；PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜处理的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的琼脂板上形成了清晰的抑菌圈，其中含大肠埃希菌的琼脂板上的抑菌圈为(3.5±0.3)mm，含金黄色葡萄球菌的琼脂板上的抑菌圈直径为(5.6±0.4)mm。试验结果与文献[21]研究结果一致,由此表明，Cur可以破坏细菌的细胞膜来抑制细菌的生长。因此PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜具有良好的抗菌性能。

图8 PBP/PCL与PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜的抗菌性能Fig.8 The antibacterial activity of PBP/PCL and PBP/PCL/Cur electrospun nanofiber mats

2.6 不同静电纺纳米纤维膜的细胞相容性

L929成纤维细胞在PBP/PCL与PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜上培养72 h的细胞存活率如图9所示。由图9(a)可知，细胞在两种静电纺纳米纤维膜上的存活率均高于85%。由图9(b)可知，细胞活/死荧光图(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)中仅有少数死亡的细胞，大部分的细胞都存活下来。这表明PBP/PCL和PBP/PCL/Cur静电纺纳米纤维膜具有很好的细胞相容性，并且释放出的Cur对细胞无毒。