一家系遗传性多发性骨软骨瘤的致病突变基因鉴定

张砚卓，李闪，吴成爱，陶剑锋，王倩倩，于淑男，魏祯杰，姜旭

1 北京市创伤骨科研究所分子骨科研究室，北京100035；2 北京积水潭医院矫形骨科

遗传性多发性骨软骨瘤（HME）又称遗传性多发性外生骨疣，是一种罕见的常染色体显性遗传的骨骼肌肉疾病，发病率约为1/50 000［1］。HME 的外显率100%，主要特征是长骨干骺端外生多处软骨骨疣，70%～90%的受累部位发生在股骨远端、胫骨近端、腓骨和肱骨［2］，常伴有慢性疼痛、关节活动受限、肢体畸形、身材矮小、脊柱侧凸和神经血管异常等症状。2%的HME 患者骨软骨瘤会发生恶化，转变为骨癌或骨肉瘤［3］。HME 具有遗传异质性，目前已报道3 个致病基因，分别为EXT1（MIM 608177）、EXT2（MIM 608210）和EXT3（MIM 600209）［4］。70%～95%的HME 患者由EXT1或EXT2基因突变导致，这两同源基因编码高尔基相关糖基转移酶，参与硫酸肝素生物合成［5-6］。HME 患者后代患病风险高达50%，具有较高的遗传性和致畸性，因此有必要进行基因检测或产前诊断［7］。2018年9月—2021年5月，我们收集一个中国汉族人HME 家系，对该家系中5例患者进行致病突变鉴定，以明确其遗传学病因，为家系的遗传咨询和产前诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 入选对象为2018 年就诊于北京积水潭医院的一个HME家系。先证者（Ⅲ3）出生时未见异常，因膝关节活动受限、疼痛2018 年到我院矫形骨科就诊。经X线检查胸骨、肋骨、肩胛骨、股骨、胫腓骨、手指、脚趾头等共有20 处软骨瘤（图1a～d）。对先证者家系成员进行X线检查，明确其父亲、姐姐和姐姐的两个孩子均患病。该HME 家系图见图2。先证者（Ⅲ3）自述其2岁时发病。他的父亲Ⅱ2自述7岁时发病，在股骨、胫腓骨、手指、前臂、脚踝共有6处软骨瘤（图1e）。先证者的姐姐Ⅲ2，发病年龄1 岁，脚底板、手指、胫骨共有6 处软骨瘤（图1f）。先证者大外甥Ⅳ1，发病年龄7 个月，在肋骨、肩胛骨、前臂、手指、胫骨、腓骨、脚踝共有16 处软骨瘤（图1g）。先证者小外甥IV2，发病年龄7 个月，在肋骨、肱骨、股骨、胫腓骨、锁骨、前臂、手指共有22 处软骨瘤（图1h）。患者受累部位主要集中在股骨和胫骨。所有患者因骨疣存在，使时常活动受限，并且患者父亲和其俩外甥均有肢体畸形的表型，身高也较正常人偏矮。先证者（Ⅲ3）的母亲（Ⅱ7）无任何多发性骨软骨瘤的临床表现，血液生化学检测发现：先证者、先证者之父（Ⅱ3）、姐姐（Ⅲ2）和两个外甥（Ⅳ1和Ⅳ2）血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平分别为1.05、1.09、1.07、1.07、1.08 mmol/L 低于正常值（1.16～1.42 mmol/L）。在取得家系成员的知情同意后，采集家系中5 名患者和II7 静脉外周血4～5 mL。EDTA抗凝，置于4 ℃保存。本研究获得北京积水潭医院伦理委员会批准，家系成员均签署知情同意书。

图1 HME家系X线影像图

图2 HME家系图

1.2 HME家系致病突变基因鉴定

1.2.1 基因组DNA提取 采用QIAamp（Qiagen：货号51104）血液基因组小量提取试剂盒提取外周血基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 全外显子组测序 本研究的全外显子组测序，委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成。将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成180～280 bp片段，经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA 文库。带有特异index 的文库pooling后与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将基因上的外显子捕获下来，经PCR 扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0 进行初步定量，随后使用NGS3K/Caliper 对文库的insert size 进行检测，insert size 符合预期后，使用qPCR 方法对文库的有效浓度（3 nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。库检合格，运用Illumina HiSeq2500平台进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 测序得到的数据经过基本数据过滤（Base calling、过滤接头序列、去污染），运用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）软件比对至人类基因组参考序列GRCh37/hg19 上，经ANNOVAR软件对变异位点进行注释，筛选致病变异。应用千人基因组数据（1000 g_all）、ExAC 数据库、ESP6500数据库（esp6500si_all）、gnomAD 数据（gnomAD_ALL和gnomAD_EAS）和dsSNP 等频率数据库，过滤掉频率高于1%的突变。应用预测软件SIFT（http：//sift.jcvi.org/）、Polyphen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）、Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org）、M-CAP（http：//bejerano.stanford.edu/mcap/）和CADD（http：//cadd.gs.washington.edu/）对变异位点进行致病性预测。同时使用数据库ClinVar（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、OMIM（https：//omim.org）和HGMD（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）确定变异是否被收录。根据2015年美国医学遗传学与基因组学学会（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南对变异致病性进行分级。

1.2.4 PCR-Sanger 测序 从UCSC 人类基因组数据库获得EXT1（NM_000127.2）基因序列，使用在线引物设计软件Primer5.0，针对候选变异设计特异性引 物（EXT1-E6-F：5’-ATACCATGGGAGAGACAGCA-3’和EXT1-E6-R：5’-GTAACGAGGCAGGATGAATG-3’），以家系成员基因组DNA 为模板，扩增变异位点所在的EXT1基因的第六个外显子。PCR反应体系：正反向引物各0.75 μL（10 pmol/μL），La taq 聚合酶0.25 μL，2×GC buffer I 12.5 μL，无菌去离子水6.25 μL，DNA 模板100 ng；PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行36 个循环；72 ℃延伸8 min。测序产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司，采用ABI3730xl 测序仪进行测序。测序结果经Codon-Code Aligner序列分析软件分析。

2 结果

根据全外显子组测序结果，用Sanger 测序对先证者和家人进行突变验证。结果表明：先证者EXT1基因第6 外显子存在杂合突变c.1468dupC，该突变导致EXT1基因编码的蛋白第490 位亮氨酸转变为脯氨酸，并在其后的第31 位形成终止密码子（p.Leu490Profs*31，见图3）；该突变可引起EXT1基因mRNA 的翻译提前终止，导致蛋白质功能缺失。家系中其他4例患者（Ⅱ3、Ⅲ2、Ⅳ1和Ⅳ2）均检测到与先证者相同的突变（c.1468dupC），表型正常的家系成员未检测到该位点的变异。家系验证结果表明，家系内存在基因型与表型共分离。多个同源序列比对分析表明，EXT1基因c.1468编码的第490位亮氨酸在多种不同生物种属内均是保守的。

图3 EXT1基因c.1468dupC变异位点Sanger测序结果

3 讨论

HME 是一种遗传异质性的骨骼系统疾病，患病率为1/50 000，主要影响软骨内骨生长。外生骨疣的数量和大小不一，病变的位置也不同［8-9］。该疾病的特征是形成大量的软骨帽和良性骨肿瘤（外生骨软骨或骨软骨瘤），通常伴有骨骼畸形和身材矮小。在少数患者中，外生软骨会发生恶性转化，导致骨肉瘤或软骨肉瘤［10］。HME 患者膝关节畸形的发生率很高，约有1/3 的患者发展为膝外翻。30%～60%的HME患者中可见前臂弓状畸形，患者其他骨骼畸形还包括肢体长度不一致、下肢外翻畸形和脊柱侧凸。与女性患者相比，男性患者通常表现出更严重的症状，这可能是由于男性生长板闭合较晚，从而有更多的时间形成外生骨瘤造成的。此外，有较多外生骨的患者通常有较严重的残疾和畸形［10］。该疾病没有特异性药物，只能在恶变的情况下手术切除症状最明显、问题最严重的骨软骨瘤［3］。70%～95%的HME 患者是由EXT1和EXT2突变所致，其中EXT1占56%～78%，EXT2占21%～44%［10］。EXT基因家族由肿瘤抑制基因组成，其功能的丧失或失调导致HME。EXT蛋白是定位于内质网的Ⅱ型跨膜蛋白，包括一个N 端细胞质尾部、一个跨膜结构域、一个柄和一个大的球状结构域［11-13］。EXT1和EXT2在高尔基体中形成异寡聚糖基转移酶，并与糖基转移酶活性密切相关，通过交替添加GlcAc 和GlcNAc残基延长HS链，参与硫酸肝素（HS）聚合［14］。EXT1/EXT2复合体比单独的EXT1或EXT2具有更高的糖基转移酶活性。由于HME 具有异质性，且EXT1/EXT2基因片段较大，又缺少突变热点，应用WES 技术于HME患者突变鉴定［15］。

多发性骨软骨瘤通常在儿童和青少年时期增加骨肉瘤的大小和数量。尽管它们对长骨的近骨骺端区有偏好，但事实上可以出现在身体的任何骨骼上，包括短骨、扁骨和不规则骨［12］。研究［16-18］表明，许多HME 患者在发病早期甚至后期都没有任何临床症状。在我院矫形骨科接诊的患者中，一家系中三代出现患者，且全部自愿接受致病突变基因鉴定的情况并不常见。本研究所收集的家系中，所有患者因外生骨疣使活动受限，但软骨未恶化成骨肉瘤或软骨肉瘤，且患者未采用手术治疗。家系中成年患者（Ⅱ2、Ⅲ2 和Ⅲ3）身高均低于正常人，且先证者父亲（Ⅱ2）和他俩外甥（Ⅳ1 和Ⅳ2）均有四肢畸形。从患者的临床表型、四肢畸形和骨疣数量，我们观察到患者严重程度在家系中呈现出早现的现象。在患者血液生化检测中发现，HDL-C 低于正常值。HDL-C 是体内重要的脂蛋白，它的生物学功能主要体现在参与胆固醇的逆向转运，改善血管内皮功能，减少黏附因子表达，逆转低密度脂蛋白氧化及抗凋亡等多个方面。研究发现HDL-C 水平与心血管病风险呈负相关，血浆HDL-C 每上升0.026 mmol/L，心血管事件发生风险可下降2%～3%。在血浆HDL-C组成及形成过程中最关键蛋白为apoA1和ABCA1［17］。在我们的研究中未发现apoA1 和ABCA1 的异常（含量及基因检测）。至今，未见HME 与HDL-C 相关性研究报道。HME 导致血浆HDL-C 水平降低还是两者互不相干而是由其他原因引起的HDL-C 水平降低，这些问题我们将进一步进行探究。

本研究我们通过全外显子组测序对一个常染色体显性遗传的HME家系进行致病突变分析，发现该家系是由EXT1基因第6 外显子的一个移码突变c.1468dupC（p.Leu490Profs*31）导致，该突变导致第490位后的编码氨基酸发生移码，并在第521位引入终止密码，使EXT1基因编码全长为746氨基酸组成的肽链缩短至由521 个氨基酸组成的截断型蛋白。EXT1基因编码硫酸肝素生物合成所需的糖基转移酶。EXT1基因上的致病突变引起硫酸乙酰肝素聚合酶合成障碍或降解，调节软骨细胞增殖成熟的信号被破坏，导致骨骺生长板发育异常，但其中的具体调控机制并不清楚［11-15］。迄今为止，数据库Human Gene Mutation Database （HGMD，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.html）和Multiple Osteochondromas Mutation Database（MOdb，http：//medgen.ua.ac.be/LOVD）已报道数563 种EXT1和267种EXT2基因突变与HME 相关，随机分布于各个外显子区域［6］。大多数已知的致病变异会导致截断蛋白的产生，如移码突变、无义突变和剪接位点突变，错义变异并不常见。检索HGMD 数据库发现，本研究在一个中国人HME家系中发现的上述突变，曾在日本人群中被报道，再次证实了该突变的致病性［16］。

总之，我们在中国HME 家系中发现一个EXT1基因的突变，该结果进一步扩展了EXT1基因的突变谱，有利于后续的遗传咨询和产前诊断，也为研究HME发病机制提供更多依据。