子宫内膜癌组织中miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA的表达变化及其意义

吴晓蕊，靳荣，卢慧

天津市第五中心医院妇产科，天津300450

子宫内膜癌是起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤，为女性生殖系统常见恶性肿瘤，全球发病率为10.8/10 万，约41.7 万例［1］。早期子宫内膜癌的肿瘤局限于子宫体，手术切除病灶可取得较好预后，但对于晚期子宫内膜癌，术后转移复发几率高，尽管近年靶向和免疫治疗显著进步，但患者生存率仍不能令人满意［2］。肿瘤是多因素、多基因变异参与的过程，非编码RNA 是一类不编码蛋白质的RNA，参与调节细胞增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡等行为，在子宫内膜癌发生发展中发挥重要调控作用［3-4］。微小RNA-128-3p（miRNA-128-3p）是 一 种 高 度 保 守的miRNA，其参与宫颈癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤进展［5-6］。缺口受体1（Notch1）是一种配体激活的转录因子，能与同源配体相互作用而改变蛋白构象，激活下游特定靶基因表达，在细胞发育、分化、增殖、凋亡等过程中发挥调节作用［7］。B 细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1（BMI1）是多梳抑制复合物1复合体的一个组分，能通过修饰染色质，参与细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等调控［8］。研究报道，Notch1和BMI1在子宫内膜癌中高表达，与癌细胞恶性行为相关［9-10］。2014 年10 月—2018 年10 月，我们观察了子宫内膜癌组织中miR-128-3p 及Notch1、BMI1 mRNA的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014 年10 月—2018 年10 月天津市第五中心医院收治的子宫内膜癌患者50例，年龄35～76（50.25±5.66）岁；组织学分型：子宫内膜样癌（EEC）124 例，非子宫内膜样癌（NEEC）26例；分化程度：低分化59 例，中高分化91 例；国际妇产科联盟（FIGO）分期［11］：Ⅰ～Ⅱ期91 例，Ⅲ～Ⅳ期59 例；血管侵犯：有36 例，无114 例；淋巴结转移：有60 例，无90 例。纳入标准：①经术后病理检查确诊为子宫内膜癌；②入院前未接受任何放疗、化疗、免疫治疗、激素治疗等；③病理资料和随访资料完整者。排除标准：①合并其他部位肿瘤者；②非原发性性子宫内膜癌者；③严重心、肝、肾等脏器疾病者；④全身感染性疾病者；⑤合并其他严重妇科疾病者。手术留取子宫内膜癌及其癌旁（距离癌组织＞5 cm）组织各150 例份，新鲜组织获取后立即分装于冻存管中置放入液氮保存。本研究经医院伦理委员会批准，且患者及家属均知情同意。

1.2 子宫内膜癌组织中miR-128-3p 及Notch1、BMI1 mRNA 检测 取出液氮冻存组织，加入TRIzol（上海捷瑞生物工程有限公司，货号：GK3006）裂解提取组织总RNA，核酸蛋白测定仪（德国艾本德，型号：BioPhotometer plus）测定总DNA 浓度及纯度，使OD260/OD280为1.8～2.0，Takara 试剂盒反转录合成cDNA，使用qRT-PCR 仪（美国伯乐公司，型号：S1000）和试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司，货号：639506）进行qRT-PCR 扩增。miR-128-3p 上游引 物：5′-GGAATTCAACCAACTGTCAATAACTGGAG-3′，下游引物：5′-CGGGATCCAATTTGTCATCCAAATCTACTTTGG-3′；内 参U6 上 游 引 物：5′-TGAACGCCGAGGGTGAGTGTCG-3′，下游引物：5′-CGGAACGTGACGTGTGGCGTACG-3′；Notch1 上游引物：5′-CGTGTGAACCCGTAGGCGCC-3′，下游引物：5′-GGCCAACGTGTGCAAGCGACGGC-3′；内参GAPDH 上 游 引 物：5′-GCGATAAGTGCTGAGCTGCTC-3′，下游引物：5′-GTTGACGCGAACTGACGTGT-3′；BMI1 上游引物：5′-CTGGTTGCCCATTGACAGC-3′，下 游 引 物：5′-CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3′；内参GAPDH 上游引物：5′-TGCACCACCA ACTGCTTAGC-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。反 应 体 积 共20 μL：10 μL 2×All-in-One qPCR Mix；2 μL上游、下游引物；2 μL cDNA 模板；4 μL 经DEPC 处理水。反应条件：95 ℃预变性10 min 1 次；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，循环40次。反应结束后得到各反 应 管Ct，构 建 溶解 曲线，采 用2-ΔΔCt法 计算 组织中miR-128-3p及Notch1、BMI1 mRNA相对表达量。

1.3 随访方法 通过门诊或电话方式随访3 年，随访至2021 年10 月，随访内容包括妇科盆腔检查、阴道B 超、胸部X 线检查，必要时进行CT 或MRI检查，统计术后3年累积生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；Pearson 相关分析法分析子宫内膜癌组织中miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达的相关性；K-M 法绘制不同miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达子宫内膜癌患者生存曲线，组间生存率比较采用Log-rank检验；多因素Cox 回归分析法分析子宫内膜癌患者死亡影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌及其癌旁组织中miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 相对表达量比较 子宫内 膜 癌 组 织 中 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 相对表达量分别为0.66±0.22、2.79±0.43、1.25 ± 0.26，癌旁组织分别为1.00 ± 0.21、2.02±0.37、0.76±0.28，两者比较，P均＜0.05。

2.2 子 宫 内 膜 癌 组 织 中 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达的相关性 子宫内膜 癌 组 织 中 miR-128-3p 与 Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达均呈负相关（r分别为-0.744、-0.733，P均＜0.05），Notch1 mRNA 与BMI1 mRNA表达呈正相关（r=0.803，P＜0.05）。

2.3 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系 结果见表1，由 表 1 可 知 ，miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达与子宫内膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴结转移有关（P均＜0.05）。

表1 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系（±s）

表1 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系（±s）

临床病理特征年龄≥50岁＜50岁组织学分型EEC NEEC分化程度低分化中高分化FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期血管侵犯有 无淋巴结转移是 否n 86 64 124 26 59 91 91 59 36 114 60 90 miR-128-3p 0.66±0.21 0.67±0.24 0.68±0.21 0.59±0.26 0.51±0.20 0.70±0.23 0.71±0.22 0.45±0.20 0.52±0.21 0.69±0.22 0.48±0.19 0.72±0.22 Notch1 mRNA 2.82±0.41 2.75±0.46 2.79±0.42 2.78±0.49 2.99±0.43 2.72±0.42 2.69±0.41 2.95±0.42 3.05±0.43 2.74±0.42 2.96±0.41 2.67±0.41 BMI1 mRNA 1.27±0.25 1.23±0.26 1.25±0.26 1.27±0.25 1.41±0.26 1.21±0.24 1.19±0.24 1.59±0.25 1.46±0.24 1.21±0.25 1.65±0.24 1.19±0.24

2.4 miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达与子宫内膜癌患者预后的关系 根据miR-128-3p、Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 相对表达量将150 例子宫内膜癌患者分为高低表达者，miR-128-3p≥0.66、0.66 者术后3 年累积生存率分别为80.56%（58/72）、57.69%（45/78），两 者 比 较，P＜0.05；Notch1 mRNA≥2.79、＜2.79 者术后3 年累积生存率分别为60.00%（45/75）、77.33%（58/75），两者比较，P＜0.05；BMI1 mRNA≥1.25、＜1.25 者术后3 年累积生存率分别为55.84%（43/77）、82.19%（60/73），两者比较，P＜0.05。

2.5 子宫内膜癌患者死亡影响因素的多因素Cox回归分析结果 随访3～36个月，中位随访27个月，死亡47 例，存活103 例。死亡者年龄≥50 岁29 例（61.70%）、EEC 40 例（85.11%）、低 分 化25 例（53.19%）、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期42 例（89.36%）、血管 侵 犯21 例（44.68%）、淋 巴 结 转 移41 例（87.23%）、miR-128-3p≥0.66 9 例（19.15%）、Notch1 mRNA≥2.79 38 例（80.85%）、BMI1 mRNA≥1.25 40 例（85.11%），存 活 者 年 龄≥50 岁57 例（55.34%）、EEC 84 例（81.55%）、低 分 化34 例（33.01%）、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期17 例（16.50%）、血管 侵 犯15 例（14.56%）、淋 巴 结 转 移19 例（18.45%）、miR-128-3p≥0.66 63 例（61.17%）、Notch1 mRNA≥2.79 37 例（35.92%）、BMI1 mRNA≥1.25 37 例（35.92%），两者低分化比例、FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期比例、血管侵犯比例、淋巴结转移比例、miR-128-3p≥0.66 比例、Notch1 mRNA≥2.79 比例、BMI1 mRNA≥1.25 比例比较，P均＜0.05。以随访时间为时间变量，年龄（≥50岁=1，＜50岁=0）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、FIGO分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、血管侵犯（有=1，无=0）、淋巴结转移（有=1，无=0）、miR-128-3p（≥0.66=1，＜0.66=0）、Notch1 mRNA（≥2.79=1，＜2.79=0）、BMI1 mRNA（≥1.25=1，＜1.25=0）为自变量，是否死亡（是=1，否=0）为因变量，多因素Cox 回归分析显示，FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋 巴 结 转 移、Notch1 mRNA≥2.79、BMI1 mRNA≥1.25为子宫内膜癌患者死亡独立风险因素，miR-128-3p≥0.66 为独立保护因素（P＜0.05），详见表2。

表2 子宫内膜癌患者死亡影响因素的多因素Cox回归分析结果

3 讨论

子宫内膜癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，通常发生于绝经后，临床症状以不规则阴道流血、排液为主，其相关危险因素包括持续雌激素暴露、初潮早、未育、绝经延迟、代谢异常、携带子宫内膜癌遗传易感基因等，近年来由于低运动量和高脂高热饮食生活方式的影响，子宫内膜癌发病率呈年轻化和上升趋势，严重影响女性生理和心理健康［12-14］。目前，子宫内膜癌的治疗仍以手术为主，放疗和化疗为辅，对于早期子宫内膜癌一般预后较好，但仍有部分患者可能存在癌灶转移，同时对于晚期存在宫外转移患者，即使进行多学科协作治疗也难获得良好预后，因此亟需阐明子宫内膜癌发病机制，寻找评估预后指标对改善患者预后具有重要意义。

miRNA 是约22 个核苷酸组成的非编码RNA，能在3′-非翻译区与靶基因的mRNA结合，导致靶基因转录后沉默，从而调控靶基因表达，在肿瘤发生发展中发挥致癌或抑癌作用［15］。研究［16-17］表明，子宫内膜癌发生发展过程中存在多种miRNA 的异常表达，对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、浸润等生物学行为产生影响。miR-326能靶向抑制B细胞淋巴瘤/白血病-2 表达，抑制子宫内膜癌细胞增殖和促进凋亡［16］。miR-501 能靶向抑制同源框D10 表达，促进子宫内膜癌细胞增殖和转移［17］。miR-128-3p是新近发现的一种miRNA，其在多种恶性肿瘤中异常表达。杨吉鹏等［18］发现，miR-128-3p 在胶质母细胞瘤中低表达，能靶向抑制同源框A5 抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭及抗凋亡能力。BAI 等［19］认为，miR-128-3p在结直肠癌中高表达，能通过抑制叉头框O4 激活JAK 激酶/信号转导和转录活化因子3和转化生长因子β/SMAD 信号调节上皮间质转化，促进结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭。上述研究提示，miR-128-3p 在不同恶性肿瘤中发挥致癌或抑癌基因作用。本研究显示，与癌旁组织比较，子宫内膜癌组织中miR-128-3p 表达降低，并且与子宫内膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴结转移有关，提示miR-128-3p 在子宫内膜癌中发挥抑癌基因作用。文献［20］报道，上调miR-128-3p 表达能抑制子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力。本研究还显示，miR-128-3p 高表达者术后3 年累积生存率明显升高，生存时间明显延长，提示miR-128-3p 低表达与子宫内膜癌患者预后不良相关；miR-128-3p 高表达是子宫内膜癌患者死亡的独立保护因素，说明miR-128-3p可作为判断预后的分子标志物。

既往研究认为肿瘤的发生原癌基因激活和抑癌基因失活有关，近年研究认为信号转导途径异常，导致细胞接受异常增殖、分化信号是肿瘤发生发展的关键因素［21］。Notch1 作为一种配体激活的转录因子，能将胞外信号转化为核内基因表达，进而调控细胞表面受体和核转录，其信号通路是一条进化保守的细胞间相互作用机制，在细胞发育、增殖、分化、凋亡中发挥重要作用，能通过激活核因子-κB、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白等多条信号通路促进肿瘤细胞增殖、分化、迁移、上皮—间质转化等行为［22-23］。本研究显示，与癌旁组织比较，子宫内膜癌组织中Notch1 mRNA 表达升高，并且与子宫内膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴结转移有关，提示Notch1 在子宫内膜癌中发挥致癌基因作用，其机制可能与Notch1 可激活多条肿瘤相关信号通路促进子宫内膜癌恶性进展有关。牛丽佳等［24］认为，Notch1 能诱导子宫内膜癌细胞上皮—间质转化，促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭。本研究还显示，Notch1 mRNA 高表达者术后3 年累积生存率明显降低，生存时间明显缩短，提示Notch1 mRNA高表达与子宫内膜癌患者预后不良相关；Notch1 mRNA高表达是子宫内膜癌患者死亡的独立风险因素，说明Notch1 mRNA 可作为判断预后的分子标志物。

多梳基因家族是重要的表观遗传修饰基因，与细胞增殖和细胞周期密切相关，在肿瘤发生发展中发挥关键作用，BMI1是首个被鉴定的多梳基因家族功能基因，作为一种原癌基因，BMI1 能通过调控WNT/β-连环蛋白、Notch、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B、c-Jun 氨基端激酶等信号通路参与恶性肿瘤发生发展［25-27］。本研究显示，与癌旁组织比较，子宫内膜癌组织中BMI1 mRNA表达升高，并且与子宫内膜癌分化程度、FIGO 分期、血管侵犯、淋巴结转移有关，提示BMI1 在子宫内膜癌中发挥致癌基因作用，其机制可能与BMI1能调节多种肿瘤信号通路有关。研究［28-29］报道，BMI1能增加磷酸化蛋白激酶B水平，促进子宫内膜癌细胞增殖、分化、迁移等行为，沉默BMI1表达能发挥相反作用，同时能提升子宫内膜癌细胞的化疗敏感性，促进癌细胞凋亡。本研究还显示，BMI1 mRNA 高表达者术后3 年累积生存率明显降低，生存时间明显缩短，提示BMI1 mRNA 高表达与子宫内膜癌患者预后不良相关；BMI1 mRNA 高表达是子宫内膜癌患者死亡的独立风险因素，说明BMI1 mRNA亦可作为判断预后的分子标志物。

本研究还发现，子宫内膜癌组织中miR-128-3p与Notch1 mRNA、BMI1 mRNA 表达呈负相关，Notch1 mRNA 与BMI1 mRNA 表达呈正相关，说明三者可能共同参与子宫内膜癌进展，考虑与miR-128-3p与Notch1、BMI1 的3′-非翻译区存在互补结合位有关。顾晓荔等［30］的研究指出，miR-128-3p 能靶向抑制Notch1 表达抑制子宫内膜癌细胞增殖，促进细胞凋 亡。YANG 等［31］发现，miR-128-3p 能 靶 向抑 制BMI1 表达抑制视网膜母细胞瘤细胞活力、迁移、侵袭。同时研究［32］指出，BMI1 抑制剂能影响Notch 信号通路蛋白的表达和活性。但关于miR-128-3p 是否能靶向下调Notch1、BMI1 参与子宫内膜癌进展有待进一步细胞研究证实。

总之，子宫内膜癌组织中miR-128-3p 低表达，Notch1、BMI1 mRNA高表达，均与分化程度、FIGO分期、血管侵犯、淋巴结转移有关，是子宫内膜癌患者死亡的独立影响因素，可能成为子宫内膜癌患者预后评估生物标志物。