基于网络药理学探讨扶正抑瘤方治疗前列腺癌的作用机制和分子靶点

甘 澍， 王树声， 陈志强， 古炽明， 向松涛， 李思逸， 吕立国， 黄芝英

前列腺癌在全球男性中的发病率仅次于肺癌[1]。在中国，前列腺癌是发病率增长最快的男性恶性肿瘤[2-4]，超过2/3的患者就诊时已是晚期[5]。根据GLOBOCAN 2018数据，与前列腺癌发病率较高的欧美国家相比，中国前列腺癌患者的预后更差，病死率更高[6]。雄激素剥夺（去势）是晚期前列腺癌的首选方案[7]，然而，在接受去势治疗两年后，几乎所有患者对去势不再敏感，进展为去势抵抗性前列腺癌。虽然治疗策略和治疗药物在持续更新发展，全球各地区晚期前列腺癌患者的总体生存率依然未取得实质性改善，晚期前列腺癌尤其是去势抵抗性前列腺癌的治疗仍然是个世界性难题[8]。

前列腺癌是中医优势病种[9]。医家普遍认为前列腺癌以肾虚为本[10]，并在补肾的基础上衍生出金水相生法[11]、健脾益肾法[12]、补益肺肾[13]等辨证诊疗思路。临床治疗经验表明，中医药治疗很可能成为去势抵抗性前列腺癌的首选治疗策略，中西结合治疗前列腺癌具有非常大的临床意义。

扶正抑瘤法系广东省中医院陈志强教授根据多年临床经验总结的分期辨证治疗策略[14]，扶正抑瘤方是基于该治疗策略的基础方剂，由黄芪、人参、枸杞、灵芝、淫羊藿、姜黄、丹参、重楼、全蝎等9味中药组成。去势抵抗性前列腺癌患者予以扶正抑瘤法治疗后，前列腺特异性抗原（PSA）水平能得到更有效的控制，临床症状改善明显，生活质量明显提高[15-17]。虽然扶正抑瘤法在治疗晚期前列腺癌方面积累了丰富的临床经验，但是扶正抑瘤方治疗晚期前列腺癌的作用机制仍然没有阐明。系统研究扶正抑瘤方治疗前列腺癌的作用及其机制有助于有助于丰富“扶正抑瘤”法治疗前列腺癌的科学内涵，促进扶正抑瘤方的临床标准化使用。本文采用网络药理方法分析扶正抑瘤方治疗前列腺癌的潜在作用机制和分子靶点，旨在为后续的实验研究提供线索和依据。

1 资料与方法

1.1 扶正抑瘤方的化合物成分检索及化合物靶点筛选 利用TCMSP[18]等数据库查询各单味药所含的化合物，同时查阅相关文献对化合物种类进行补充，利用TCMSP、SwissTargetPrediction[19]等数据库对补充的化合物进行ADME/T预测，以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性指数（DL）≥0.18为标准对化合物进行筛选。在TCMSP数据库中检索化合物靶点，以UniProtKB数据库获取的人源基因列表为参考，对化合物潜在靶点的protein name进行gene name转换。

1.2 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点筛选 以“prostate cancer”为关键词在Genecards、OMIM等数据库检索前列腺癌疾病靶点，通过Venny 2.1.0在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对化合物靶点和前列腺癌疾病靶点进行映射，得到扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点。

1.3 蛋白相互作用网络（protein-protein interaction,PPI）构建 共同靶点上传至STRING 11.0数据库（https://string-db.org），将“organism”设定为“homo sapiens”，将“minimum required interaction score”设定为“highest confidence (0.900)”，分析生成PPI网络图；通过cytoscape 3.8.0的MCODE插件筛选PPI网络图中的关键module。

1.4 扶正抑瘤方-前列腺癌靶点GO富集和KEGG富集分析 共同靶点上传至DAVID 6.8进行GO注释、富集和KEGG通路富集分析，用微生信可视化平台（http://www.bioinformatics.com.cn）对分析结果进行可视化展示。

1.5 扶正抑瘤方-前列腺癌“方-药-成分-靶点-通路”网络图构建 上述各步骤分析数据按要求整理好后导入cytoscape 3.8.0[20]，生成“方-药-成分-靶点-通路”网络图，分析“药物-成分”“成分-靶点”“靶点-通路”的连接关系，保存分析结果；根据可视化展示需求调节节点参数。

2 结果

2.1 扶正抑瘤方的化合物成分及其潜在靶点 通过TCMSP数据库获得各单味药符合ADME 属性标准的化合物如下：人参17个，黄芪17个，灵芝14个，枸杞36个，淫羊藿23个，丹参59个，姜黄3个。TCMSP数据库尚未收录全蝎和重楼相关数据，故通过检索BAT-MAN、ETCM等数据库和相关文献进行补充，重楼以重楼皂苷为主，全蝎主要以脂类、挥发油、多肽和蛋白类成分为主，检索获得的化合物通过SwissTargetPrediction数据库进行ADME评估，未获得符合标准的化合物。至此，合并、删除重复项，共获得158个化合物。

在TCMSP数据库中对化合物进行靶点检索，合并、删除重复项后，各单味药的靶点数为：人参114个，黄芪208个，灵芝24个，枸杞201个，淫羊藿219个，丹参135个，姜黄32个，合并各单味药的靶点，删除重复项后，共得255个化合物靶点。

2.2 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点分析Genecards数据库中共获得前列腺癌疾病靶点11 719个。Venny 2.1.0对扶正抑瘤方化合物靶点和前列腺癌疾病靶点进行映射后，共获得233个扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点（图1）。

图1 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点

2.3 PPI网络 233个共同靶点提交至STRING 11.0数据库，共获得1 098条PPI连接线（图2）。不同的蛋白分子形成复合体，可促进信号转导、或提高蛋白稳定性，或形成功能复合物发挥特定的生物学作用，类似这样的复合体称之为module。本研究将PPI网络图导入cytoscape 3.8.0软件，利用其MCODE插件进行module分析，前10位的module及功能信息见图3和表1。注：仅列出富集度前3位，不够3条GO terms的全部列出，P均＜0.05（即-lg(P)＞1.30）

图2 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点PPI网络图

图3 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点PPI网络中的module

表1 module功能分析信息

2.4 GO富集和KEGG pathway富集分析 GO注释结果表明，扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点影响细胞增殖、凋亡、DNA转录等生物学过程（BP）；是细胞核、细胞质、质膜等细胞结构的主要组成部分（CC），大多数共同靶点能与蛋白、酶、锌离子、DNA等结合，催化蛋白二聚化，部分具有蛋白具有转录调节活性（MF），GO注释结果部分展示于图4。

图4 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点GO富集图

KEGG分析表明，扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点共富集于125条不同通路中（P＜0.05），富集度前20位的通路见图5，图中气泡形状大小表示富集于该信号通路的基因数量，气泡越靠右，基因富集度越高；气泡颜色表示P值，颜色越红，P值越小，统计学差异越显著。

图5 扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点KEGG pathway富集分析气泡图

2.5 扶正抑瘤方-前列腺癌“方-药-成分-靶点-通路”网络图 以复方、单味药、化合物、靶点、信号通路为节点，进行网络分析，网络图见图6，网络图中，灰色八边形代表扶正抑瘤方（FZYLF）；圆形表示单味药（以药物名称拼音开头大写字母标注），红色圆表示君药，橙色圆表示臣药，绿色圆表示佐药；蓝色正方形表示化合物，各化合物以单味药拼音开头大写字母+数字标注，C1～C7表示不同单味药间的共有化合物；六边形表示扶正抑瘤方-前列腺癌共同靶点，其黄-蓝渐变填充色随节点度（degree）改变，颜色越蓝，节点度越高；绿色的倒三角形表示不同的KEGG信号通路，其大小表示共同靶点在该通路的富集度改变，倒三角形形状越大，富集度越高。

图6 扶正抑瘤方-前列腺癌“方-药-化合物-靶点-通路”网络图

节点度值（degree）表示与该节点存在相互作用关系的其他节点越多，节点度前5位的的化合物依次是：槲皮素、山奈酚、木犀草素、7-O-甲基异微尖头酚、丹参酮IIA；节点度前5位的靶点依次是：PTGS2、NCOA2、PTGS1、ADRB2、SCN5A。

3 讨论

扶正抑瘤方的主要活性成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素等。以往研究表明，这些化合物均具有良好的抗前列腺癌活性。槲皮素调控PI3K/AKT/mTOR、MAPK、AR等信号通路[21]，诱导前列腺癌细胞自噬或凋亡，增强前列腺癌细胞对放、化疗的敏感性；山奈酚调节AR信号通路，抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭等[22]；木犀草素抑制前列腺癌细胞中Wnt通路激活[23]，还可抑制去势抵抗性前列腺癌细胞AR及AR-V7的表达[24]。

扶正抑瘤方治疗前列腺癌的靶点主要包括PTGS2、PTGS1、NCOA2等。PTGS2 基因DNA甲基化水平是临床局限性前列腺癌患者生化复发的独立预后标志物[25]。雄激素剥夺可诱导NCOA2表达，NCOA2进一步激活PI3K，介导前列腺癌转移、发展[26]。

PI3K-Akt是扶正抑瘤方治疗前列腺癌的主要潜在信号通路。PI3K-Akt通路是在肿瘤细胞中最为常见的异常激活的信号通路[27]，研究人员在42%的早期前列腺癌病例和74～100%的晚期前列腺癌病例中发现了PI3K-Akt信号的异常[28]，PI3K-Akt通路的异常激活与前列腺癌去势抵抗、疾病进展和预后差有关[29-30]。

综上所述，扶正抑瘤方中的槲皮素、山奈酚、木犀草素等多个活性成分可能通过抑制前列腺癌中异常激活的PI3K-Akt等信号通路，调节基因转录，影响PTGS2、PTGS1、NCOA2等关键靶点的表达或活性，从而抑制前列腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，发挥治疗前列腺癌的药理活性，其发挥治疗作用的具体药效方式及作用机制有待于进一步的实验验证。