运动马粪样微生物对黑麦草等几种牧草的体外发酵研究

曹 允，张 洁

（北京农业职业学院畜牧兽医系，北京 102442）

运动马因运动剧烈对饲料能量的要求比普通繁殖马高很多。传统运动马饲料以谷物饲料为主，谷物饲料中的淀粉为其提供能量，但单一的谷物饲料存在很多不足。有研究评价指出[1]，谷物饲料中的淀粉会导致马胃溃疡，从而对马匹的行为表现产生严重的不良影响，由相同比例的干草和谷物组成的日粮对断奶生长马的增重效果高于单纯的谷物饲料。高谷物饲料也可能会导致高血糖、胰岛素等一系列代谢问题。另有研究发现[2]，高强度运动期间，在运动马日粮中添加高能量纤维饲料不会对糖原利用或肌肉乳酸清除产生不利影响，并且仅含干草料的饲料可以抵消高强度运动引起的酸中毒。干草、甜菜浆、大豆壳等高能纤维饲料能满足赛马等运动马能量需求的能力。任万路[3]等提出，将优质牧草喂给运动马，在此基础上适当降低谷物饲料的比例有利于运动马的营养需求。由此可见，运动马的饲料配比要兼顾谷物饲料和粗饲料的平衡使用以保障马匹的健康和能量。

体外分析法是评定动物饲料营养价值的主要方法，借助生物学方法体外模拟动物消化过程估测饲料消化率，但体外法主要用于评定反刍动物饲料营养价值[4]，用体外发酵技术研究单胃动物饲料发酵特性的报道还较少，且主要集中在非淀粉多糖和寡糖的发酵特性研究。有学者改进了体外产气法，并将其应用到猪营养研究中，该方法主要用猪盲肠内容物作为菌源，离心冻干的盲肠内容物作为发酵底物[5]。体外发酵模型具有操作简单、经济、快速等优点，是一种理想的研究单胃动物后肠发酵的模型[6]。肠道微生态学的发展使单胃动物的后肠发酵过程越来越受到关注。普遍认为，发酵过程和终产物对动物健康有重要影响。

马肠道中寄生着大量的微生物菌群，这些微生物用来帮助分解粗饲料中的纤维，马属于后肠发酵动物，80 % 的纤维在其后肠中完成降解。这些微生物能以粗纤维为碳源，将粗纤维发酵成脂肪酸，供给宿主基本的能量需要[7]。本试验以运动马新鲜粪便为底物发酵黑麦草、菊苣和小麦草，通过纤维素和半纤维素含量的测定、发酵产气性能、发酵产物等评估运动马肠道微生物对不同草料粗纤维的利用，为牧草粗纤维作为运动马饲料添加提供理论依据，同时也为体外发酵法研究单胃动物后肠发酵提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 草料纤维的制备 粗纤维草料选择黑麦草、菊苣、小麦草干草。将干草剪成2～3cm 小段，粉碎过20 目筛（0.85 mm）作为发酵用草料备用。

1.1.2 运动马粪样的采集 粪样采集于2021 年9月北京农业职业学院健康运动马5 匹。采集新鲜的粪样并迅速置于厌氧袋中，带回实验室后迅速放于厌氧箱中备用。

1.1.3 发酵接种底物的配制 在厌氧箱中取8 ml灭菌生理盐水与2 g 粪样进行混合，混匀后用无菌纱布过滤2 遍，去除粪样中的残渣，所得滤液为发酵接种底物。

1.1.4 无碳培养基的配制 无碳培养基能选择利用特殊碳源的微生物，在此实验中能保证马粪样微生物以粗纤维作为碳源进行体外发酵。具体成分如下表1[8]。

表1 无碳培养基成分

培养基使用之前新鲜配制，配制时按照下列比例和顺序加入：蒸馏水（800 ml）+ A（0.2 ml）+ B（400 ml）+ C（400 ml）+ D（2 ml）+E（80 ml）。用CO2饱和后预热至39 ℃。

1.2 方法

1.2.1 体外发酵实验设计 按照表2 的发酵方案设计发酵组（发酵总体积为50 ml，发酵接种底物接种量占总体积的1 %，草料纤维添加量为1 %），每个发酵组设置5 组重复，将每个发酵组置于发酵瓶中于37℃培养箱中，发酵48 h。

表2 发酵组设计方案

1.2.2 发酵前后纤维素和半纤维素含量的测定取发酵前的干草1.00 g（40 目筛）及发酵后的发酵液50 ml，根据范式洗涤法[9]，经中性洗涤剂煮沸处理及酸性洗涤剂处理后，测定纤维素和半纤维素的含量。

1.2.3 发酵产气量的测定 以50 ml 坐式发酵管测定不同发酵组 1 h、2 h、3 h、4 h、12 h、18 h、24 h、48 h 的产气量，以发酵管中气柱下降高度计为产气量。

1.2.4 挥发性脂肪酸的测定 准确称取1.00 g 发酵物（48 h），置于50 ml 离心管中，加入5 ml体积比1:1 的甲醇-水溶液（含0.2 % HCl），涡旋混匀1 min 后500 W 超声波提取15 min，待溶液冷却后8 000 r/min 离心5 min，取上清液通过0.22 µm 滤膜后以GC-MS 法[10-11]进行发酵物中6种挥发性脂肪酸的测定。

1.2.5 数据分析 所有数据经excel2003 初步整理计算后，采用spassv21.0 软件进行统计学分析。数据以平均值±标准误表示，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 体外降解纤维性能

由表3 可知，3 种干草发酵前纤维素和半纤维素含量均有差异，纤维素和半纤维素含量为：黑麦草＞小麦草＞菊苣。各种干草与运动马粪样底物进行发酵后，干草中纤维素和半纤维的含量较发酵前均有显著性下降（P＜0.05）。

表3 各干草纤维素和半纤维素发酵前后的含量 （%）

根据公式：纤维素或半纤维素降解率=（发酵前的纤维素或半纤维素总量-发酵后的纤维素或半纤维素总量）/发酵前的纤维素或半纤维素总量。

结果为：黑麦草、小麦草和菊苣纤维素平均降解率为11.13 %、12.22 %、30.94 %，半纤维素平均降解率为27.46 %、11.19 %、14.64 %，粪样微生物对纤维素和半纤维素的降解率：菊苣＞黑麦草＞小麦草。

2.2 体外发酵产气性能

运动马粪样微生物对不同干草发酵后产气性能见表4。前4 h 发酵过程中，黑麦草、小麦草产气量无显著差异，菊苣与其他2 种干草相比，产气性能显著性提高（P＜0.05），表现为产气速度与产气量较其他2 种干草高。在发酵12~24 h中，黑麦草的产气性能较其它干草显著性差（P＜0.05），其它2 种干草无显著性区别。到48 h终末，3 种干草的产气总量无显著差别（P＞0.05）。

表4 各发酵组产气量 （ml）

2.3 发酵后挥发性脂肪酸（VFA）浓度

粪样微生物发酵3 种干草后的发酵产物VFA种类及浓度见表5。由表5 可知，3 种干草经发酵后产生的乙酸浓度最高，显著高于其它各类VFA（P＜0.05），又尤以菊苣产生的乙酸浓度最高，其次为小麦草和黑麦草。丙酸、正丁酸、异丁酸、异戊酸的浓度高低依次为菊苣＞小麦草＞黑麦草，且差异显著（P＜0.05）。3 种干草产生的正戊酸浓度无显著差异。菊苣产生的VFA 总浓度最高，其次为小麦草，黑麦草产生的VFA浓度最低。

表5 各发酵组产生挥发性脂肪酸种类及浓度 （µg/g）

3 讨论

在传统运动马饲料中加入适量优质牧草，可以适当降低基础谷物饲料的比例。本试验利用运动马粪样微生物对包括黑麦草在内的3 种牧草干草进行体外发酵，结果表明：

（1）运动马粪样微生物对黑麦草、小麦草和菊苣中的纤维素和半纤维素有显著降解能力，且对菊苣的降解能力最强，这种降解差异可能和粪样微生物的组成和种类有关，也可能和牧草的形态、结构有关[12]。

（2）挥发性脂肪酸是厌氧消化过程的重要中间产物，对动物代谢有重要作用，对机体有许多调节功能[13]。微生物发酵干草后产生的VFA主要有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，尤以产生乙酸为主。产生不同种类的VFA 可能与不同干草中的碳水化合物以及不同微生物的发酵性能相关。本试验中，菊苣产生的VFA 总量最高，黑麦草产生的VFA 最低。

（3）微生物发酵干草的过程中会产生气体，气体包含微生物直接降解纤维产生的气体以及肠道中某些菌与VFA 形成的气体，通过测定产气量可以进一步分析牧草干草粗纤维被降解数量与生成VFA 的量[14]。在本试验中，发酵初始（4 h 内）菊苣的产气性能包括产气量和产气速度都优于其它2 种干草，发酵结束时（48 h）3种干草的产气量无显著差异。提示在发酵初始阶段（4 h 内），菊苣的纤维降解与产生的挥发性脂肪酸都优于其它2 种干草。

4 结论

在添加牧草饲料时，不仅要考虑牧草中粗蛋白（CP）的含量来保证牧草的营养价值，还要综合考虑运动马肠道微生物对纤维的降解能力，从对马的肠道健康方面还要考虑产生的挥发性脂肪酸的含量。从纤维降解能力来看，在本试验的3种牧草中，运动马粪样微生物在体外对菊苣的降解能力最强，对黑麦草降解能力最弱。从产生的挥发性脂肪酸来看，体外发酵中菊苣产生的VFA含量最高，黑麦草最低。从产气性能看，菊苣在与粪样微生物混合4 h 内，较其它2 种牧草能迅速发酵。在添加饲料时，综合考量这些因素，菊苣为3 种牧草添加中利用率较好的一种品种。