藏西北白绒山羊大肠杆菌的分离鉴定及其耐药性初探

平 措，达娃普赤，丹 增，达 瓦，次仁罗措，德 吉

（1.西藏自治区措勤县紫绒山羊原种场，西藏 措勤 859300；2.西藏自治区尼玛县白绒山羊原种场，西藏 尼玛；3.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨）

大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli），俗称大肠杆菌，多数是温血动物肠道内正常菌群成员。动物出生后数小时即可经口进入消化道后段定居，终生伴随并经粪便不断散播于周围环境。大肠杆菌大小为0.1~0.7 µm × 2~3 µm，显微镜下为两端钝圆，散在或成对存在的革兰氏阴性无芽胞的直杆菌。本菌为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37 ℃，最适生长pH 为7.2~7.4。麦康凯琼脂上形成红色菌落；在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落[1]。

羊的大肠杆菌病可分为成年羊的大肠杆菌病和羔羊的大肠杆菌病[2]。其中，成年羊大肠杆菌病主要表现为母羊乳房炎，羔羊大肠杆菌病则以败血症和腹泻为主要临床特征，发病急、致死率高，严重威胁泌乳母羊和羔羊的健康[3]。此外，大肠杆菌也是引起不同时期羊呼吸道疾病的病原之一，引起流泪、体温升高、精神沉郁等症状[4]。本试验通过对15 只藏西北白绒山羊腹泻羔羊的粪便样品进行细菌分离培养，确定其病原为大肠杆菌。随后，对菌株进行生化试验及药物敏感性试验，并对其耐药性进行检测，以期为今后藏西北绒山羊的大肠杆菌耐药性研究及防治工作提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品 腹泻羔羊粪便样品采自15 只藏西北白绒山羊腹泻羔羊。其中，西藏自治区尼玛县某白绒山羊场10 只，措勤县紫绒山羊原种场5 只。样品采集后运送至实验室进行诊断。

1.1.2 主要仪器 超净工作台购自济南鑫贝西生物科技有限公司，电热恒温培养箱购自上海跃进医疗器械厂，生物显微镜购自重庆重光实业有限公司。

1.1.3 主要试剂 麦康凯琼脂、M-H 琼脂均购自青岛海博生物技术有限公司，细菌革兰氏染液购自北京索莱宝科技有限公司，细菌生化鉴定管购自杭州滨河微生物试剂有限公司，药敏纸片根据欧盟药敏试验标准（EUCAST 2017）自行制作并保存。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离培养及纯化 在超净工作台中将采集的粪便样品接种于麦康凯琼脂平板，36±1 ℃培养24 h，24 h 后挑取平板上单独的粉红色菌落再次接种于麦康凯平板，36±1 ℃ 培养24 h，得到纯化的细菌进行后续试验。

1.2.2 革兰氏染色镜检 事先在无菌载玻片上滴一滴生理盐水，用无菌接种环挑取少量已纯化培养基上的单独菌落至载玻片上，与生理盐水混匀，用酒精灯火焰干燥固定。首先用结晶紫染液染色1 min，结束后用蒸馏水冲洗染液，之后使用碘液染色1 min，再用蒸馏水冲洗染液，之后使用酒精脱色15 s，然后用蒸馏水冲洗染液，最后用沙黄染液复染1 min，结束后用蒸馏水冲洗染液并用吸水纸将载玻片上残留液体吸干，置于油镜下观察。

1.2.3 生化试验 用接种针挑取已纯化平板上的单独菌落接种至生化鉴定培养基内，按照生化鉴定管说明书进行操作，36±1 ℃ 恒温静置培养，于24 ~ 48 h 内观察结果。

1.2.4 药敏试验 按照欧盟药敏试验标准规定的纸片扩散法（2017 版）对已纯化的分离菌进行药敏试验，使用细菌浊度仪调整菌液浓度至0.5 麦氏值，吸取50 µl 菌液均匀涂布于表面干燥的MH 琼脂平板，贴附药敏片后置于培养箱中36±1 ℃ 培养12 h 后观察结果。

2 结果

2.1 细菌分离纯化结果

经恒温培养24 h 后麦康凯琼脂平板上可见大小均一的粉红色菌落，镜检可见两端钝圆，散在或成对存在的革兰氏阴性杆菌（图1）。

图1 分离株平板及镜检形态

2.2 生化鉴定结果

根据细菌生化鉴定管结果判定说明书，判定记录分离菌的生化试验结果（表1）。将生化试验结果与《伯杰细菌鉴定手册》比对，结合菌落特征与镜检可确定分离株为大肠杆菌。

表1 分离菌生化试验结果

2.3 药敏试验结果

根据美国临床实验室标准化委员会颁布的《抗微生物药物敏感性实验执行标准》判定药敏试验结果，结果显示分离株对磺胺甲恶唑、诺氟沙星、阿奇霉素、氯霉素、四环素、环丙沙星敏感，对强力霉素、卡那霉素、多黏菌素、红霉素中介，对杆菌肽、头孢克肟、青霉素耐药（表2）。

表2 大肠杆菌药敏试验结果

3 讨论

白绒山羊产业已经成为藏西北地区农业发展和农牧民增收的重要产业，对区域经济发展具有不可替代的重要作用。羔羊腹泻一直是影响养羊业发展的重要疾病之一，产羔季节，如果饲养管理、产羔护理和疾病防控工作不到位，就可能引起羔羊大批发病[5]，严重影响羔羊正常生长发育。病毒、细菌及寄生虫感染均有可能导致羔羊腹泻[6]，其中，大肠杆菌是引起羔羊腹泻的重要病原。大肠杆菌引起的羔羊腹泻发病急、病程短、致死率较高，给养殖户带来较大经济损失。此外，由于抗生素滥用导致的耐药大肠杆菌不断出现并传播，不仅破坏动物体内微生态平衡，而且易流入人体，危害人类健康和食品卫生安全。

为调查藏西北腹泻羔羊的发病原因，本试验采集藏西北腹泻羔羊粪便，经细菌分离培养及生化试验检测，确认其病原均为致病性大肠杆菌。由于不同地区的大肠杆菌分离株血清型不一样，地区性特征明显，加之不同血清型大肠杆菌之间缺乏有效的交叉免疫保护，从而给大肠杆菌病的有效防治增加了难度[3]。现阶段针对大肠杆菌病的主要措施是加强饲养管理与环境卫生清洁，此外也可根据药敏试验的结果，适当使用对应敏感抗生素，并辅以补液治疗[7]。本研究为今后藏西北绒山羊的大肠杆菌耐药性研究及防治工作提供参考依据及临床用药指导。