地源性优势青贮发酵乳酸菌的筛选与鉴定

王 诚，刘德娟，翟桂玉，牛 星，何荣彦，董桂红，刘 雨，李 燕，王 玲，邢 烛，赵福平，巩 倩，宗 倩，董晓桐

（1.山东健源生物科技有限公司，山东 泰安 271000；2.泰安市动物疫病预防控制中心，山东 泰安；3.山东省畜牧总站，山东 济南；4.临沂科技职业学院，山东 临沂）

近年来，乳酸菌作为青贮饲料添加剂的研究越来越受到人们的重视，因为乳酸菌能够使青贮饲料尽快进入乳酸发酵产生高浓度的乳酸，抑制腐败菌的生长繁殖，提高青贮饲料的品质，提高营养价值，改善饲料适口性，促进动物采食量和生产性能。研究结果表明，乳酸菌对青贮饲料发酵起促进作用的主要因素，一是附着在青贮原料表面上的数量，二是乳酸菌的种群（质量），乳酸菌附着数量越多（当达到或超过105cfu/g 青贮原料鲜重时），乳酸菌株品质越优良（如植物乳杆菌、布氏乳杆菌等）就能制备获得优质的青贮发酵饲料，而达到此目的有效方法就是在制作青贮饲料过程中可直接添加乳酸菌菌制剂。

该试验紧密结合生产实际，在前期分离获得的6 株不同地源乳酸菌的基础上，采用多种先进的实验技术，筛选鉴定得到了2 株青贮饲料发酵优势乳酸菌，为后期研制高品质的青贮饲料添加剂奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

6 株地源性乳酸菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌菌种，均由健源生物科技有限公司提供；MRS、LB 培养基，购自青岛陆桥生物试剂有限公司；16 SrDNA 引物，由青岛生工合成；细菌基因组提取试剂盒、2xEsTaqMasterMix、琼脂糖凝胶、聚合酶等，均购自生物工程（上海）有限公司；37 ℃ 恒温培养箱、pH 酸度计、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪，由健源生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 产酸发酵效果试验 将6 株地源性乳酸菌分别接种MRS 液体培养基，置于37 ℃ 恒温培养箱培养36 h，期间每隔2 h 用酸度计分别测定各个菌种发酵液pH，检测至36 h，记录结果。

1.2.2 抑菌效果试验 将6 株地源性乳酸菌分别接种MRS 液体培养基，37 ℃ 培养36 h，然后利用直径6 mm 的滤纸片分别蘸取各乳酸菌培养液，分别均匀分布粘贴于涂有致病性大肠杆菌、沙门氏病原菌的LB 琼脂平板上，37 ℃ 孵育24 h，观察抑菌圈，用卡尺测量抑菌圈大小，记录结果。

1.2.3 PCR 鉴定 通过细菌基因提取试剂盒对产酸和抑菌效能较好的2 株乳酸菌分别进行基因组提取，应用16 SrDNA 引物（F-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG 和 R-TACGGCTACCTTGT TACGACTT），通过聚合酶链式反应PCR 扩增方法进行扩增鉴定，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果。

1.2.4 最适生长条件试验 对筛选获得的2 株产酸和抑菌效果较好的乳酸菌在不同温度、不同pH、不同接菌量、不同培养时间下检测其发酵后活菌数量，统计结果，建立较优发酵条件。实验设计见表1。

表1 试验设计

2 结果与分析

2.1 产酸试验结果

6 株地源性乳酸菌的产酸结果见表2。

表2 乳酸菌产酸效果（pH）

由表2 结果显示，有2 株乳酸菌（编号：T2和F1）培养4 h 内pH 下降最快，12 h 的pH 可降到4.0 以下，24 h 趋于平衡。

2.2 抑菌试验结果

通过抑菌试验，6 株地源性乳酸菌对致病性大肠杆菌、沙门氏菌的抑制效果见表3 和图1。

表3 乳酸菌的抑菌效果（抑菌圈直径：mm）

图1 乳酸菌对病原菌的抑菌效果图

由表3 和图1 结果表明，6 株地源性乳酸菌中的F1 株和T2 株菌对致病菌的抑制效果最好，其他株乳酸菌的抑菌效果较差。

2.3 PCR 鉴定结果

提取F1 和T2 乳酸菌的目的基因组DNA后，利用细菌的通用引物通过 PCR 扩增出16srDNA 序列，经凝胶电泳，显示1 508 bp 和1 500 bp 大小的条带（见图2）。将测序所得PCR 产物DNA 序列搜索GenBank 同源序列及基因比对结果显示，F1 株与GenBank 中布氏乳杆菌（AB368914.1）99 % 同源；T2 株与GenBank中植物乳杆菌（NR115605.1）99.52 % 同源。因此，两株乳酸菌分别是植物乳杆菌（F1 株）和布氏乳杆菌（T2 株）。

图2 2 株乳酸菌16SrDNA 扩增图

2.4 最适生长条件试验结果

根据在不同温度、不同pH、不同接种菌量、不同培养时间下两株乳酸菌的生长后的活菌数量，F1 株的最佳组合为a2b4c3d2（即温度为37 ℃，pH 为4.0，接菌量为2 %，发酵时间为36 h），T2 株为a1b3c3d2（即温度为35 ℃，pH为6.0，接菌量为2 %，发酵时间为36 h），见表3 和表4。

表3 乳酸菌T2 菌株发酵条件优化结果

表4 乳酸菌F1 菌株发酵条件优化结果

3 讨论与结论

青贮饲料是将含水分多的植物性饲料经切碎后密封，在厌氧的条件下通过乳酸菌的发酵产酸作用，抑制各种杂菌的繁殖而得到的一种粗饲料。青贮饲料具有营养丰富、气味酸香、柔软多汁、适口性好等特点，是反刍动物优良的饲料来源。另外，青贮饲料利于长期保存，可以解决冬季家畜缺少鲜饲料的问题,进而改善畜产品品质。

青贮饲料发酵过程中的微生物主要是乳酸菌，而乳酸菌的种质差异对青贮饲料的发酵品质至关重要。前期研究发现，乳酸菌添加剂在青贮过程中不仅可以产生大量的乳酸，降低青贮饲料的pH，其在发酵过程中对整个青贮饲料微生物组成产生深远影响，并产生大量对家畜具有潜在健康益处的代谢产物。为了获得优良的乳酸菌株，近年来国内外许多专家对青贮饲料用优质乳酸菌开展了分离鉴定筛选研究，许多研究成果有较大的参考应用价值。如宗亚倩等从青贮玉米中分离鉴定和筛选乳酸菌，为制作青贮饲料提供了优良菌种，对改善青贮饲料品质具有重要指导意义[1]；胡勇在自然发酵青贮玉米饲料中，通过16 SrRNA 通用引物进行PCR 扩增及测序鉴定布氏乳杆菌等乳酸菌[2]。席琳乔从青贮玉米中分离到10 株异型乳杆菌，并通过产酸和抑菌效果实验证明分离菌株均是制作青贮饲料的优良菌株[3]。Mcdonald 等论述了青贮添加剂的乳酸菌菌种应具备繁殖速度快、竞争力强、耐酸程度高、产酸速度快（pH 降低快）且产酸量大等条件[4]；据报道，植物乳杆菌和布氏乳杆菌等可具备青贮添加剂乳酸菌菌种的条件。

本研究采用常规微生物学及分子生物学技术对前期分离自泰安、费县、惠民、郓城、诸城5个不同地域的6 株（编号：F1、F2、F3、T1、T2、T3 株）乳酸菌进行了筛选试验，通过产酸、抑菌能力检测，最终确定F1 和T2 株乳酸菌为优势菌株。在此基础上，对F1 和T2 株菌的最适生长条件进行了试验，获得了有价值的数据；另外通过PCR 鉴定，探明了菌株名称，分别为布氏乳杆菌（F1 株）和植物乳杆菌（T2 株）。有研究结果发现，植物乳杆菌为同型发酵乳酸菌，布氏乳杆菌为异型发酵乳酸菌。同型发酵乳酸菌产酸量多、产酸速度快，异型乳酸菌发酵的终产物除乳酸外，还包括乙酸、乙醇等物质，这些代谢产物可有效抗御霉菌等生长繁殖，有效防止青贮饲料二次发酵及腐败。在制作青贮饲料时，可将同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌同时使用，会充分发挥两个菌作用的优势。本试验成功筛选到了植物乳杆菌和布氏乳杆菌，为研制优质青贮饲料乳酸菌添加剂奠定了坚实基础。