Sin-QuEChERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中8种喹诺酮类药物残留量

杨贤丰,王波,张欢,雷春妮,王娟,刘阿静,解迎双,*

(1.甘肃农业大学 食品科学与工程学院,兰州 730070;2.兰州海关技术中心,兰州 730010)

喹诺酮类药物以其抗菌谱广、吸收好、价格低廉等特点,在临床方面得到了较广泛的应用。但是不合理的用药可导致喹诺酮类药物及其代谢产物在水产品中的残留,进而引起食用者肠道菌群失衡以及潜在的致癌、致畸、致突变的作用[1-3]。根据喹诺酮类药物在人体内的安全摄入范围,并结合我国国情制定了一系列的限定标准,其中在NY 5070－2002《无公害食品 水产品中渔药残留限量》和NY 5071－2002《无公害食品 渔用药物使用准则》中将喹诺酮列为禁用药物[4-5]。

目前,关于食品中喹诺酮类药物残留的检测研究较多,也较为成熟。测定方法多为高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫法等。其中高效液相色谱法灵敏度低、选择性差,在检测效率上仍存在不足;酶联免疫法检测快速,但是该技术只是一个诊断的辅助手段,特异性和灵敏性有待提高,而且假阳性率较高。目前检测喹诺酮类药物较好的方法是液相色谱-质谱联用法[6-8]。

喹酮类药物残留检测中的样品前处理方法多,较为传统的方法是液液萃取法和固相萃取法,其中液液萃取法复杂耗时、浪费溶剂、准确度不高,而固相萃取法虽然准确度较高,但是操作步骤较为复杂,需要活化、上样、淋洗、洗脱等步骤,操作时间较长,整个试验过程需要2～4 h[9]。本工作基于Qu ECh-ERS和反向分散固相萃取的基本原理,以填充了多壁碳纳米管和乙二胺-N-丙基硅烷等净化填料的Sin-QuEChERS快速滤过柱对样品提取液进行净化,提出了Sin-Qu ECh ERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、二氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星和培氟沙星等8种喹诺酮类药物残留量的方法。Sin-Qu ECh ERS净化技术具有溶剂消耗低、前处理用时短(20～25 min)等优点,对于鱼肉类样品中喹诺酮类药物的批量检测有重要意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6460型超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪;3K30 型离心机;112-9669-368 型Sin-QuECh-ERS快速滤过柱;BC-1000型涡旋混匀仪;CP 224S型电子天平;BSA822型电子天平。

单标准储备溶液:100 mg·L－1,分别称取恩诺沙星标准品0.010 2 g、环丙沙星标准品0.010 5 g、氧氟沙星标准品0.010 5 g、诺氟沙星标准品0.010 2 g、二氟沙星标准品0.010 2 g、沙拉沙星标准品0.010 2 g、达氟沙星标准品0.010 2 g、培氟沙星标准品0.010 2 g、氘代诺氟沙星标准品0.010 2 g、氘代环丙沙星标准品0.010 2 g和氘代恩诺沙星标准品0.010 2 g,用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成质量浓度为100 mg·L－1的单标准储备溶液。

混合标准储备溶液:1 000μg·L－1,分别移取8种喹诺酮类药物单标准储备溶液和氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星和氘代恩诺沙星等3种内标的单标准储备溶液1.00 mL,用0.2%(体积分数,下同)甲酸溶液稀释并定容至100 mL 容量瓶中,配制成质量浓度为1 000μg·L－1的混合标准储备溶液。

混合标准溶液:100.0μg·L－1,分别移取8种喹诺酮类药物单标准储备溶液和氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星和氘代恩诺沙星等3种内标的单标准储备溶液100μL,用0.2%甲酸溶液稀释并定容至100 mL容量瓶中,配制成质量浓度为100.0μg·L－1的混合标准溶液。

内标溶液:100.0μg·L－1,分别移取氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星和氘代恩诺沙星等3种内标的单标准储备溶液100μL,用0.2%甲酸溶液稀释并定容至100 mL 容量瓶中,配制成质量浓度为100.0μg·L－1的内标溶液。

恩诺沙星标准品、二氟沙星标准品、沙拉沙星标准品、达氟沙星标准品、培氟沙星标准品、诺氟沙星标准品、氘代诺氟沙星标准品、氘代环丙沙星标准品、氘代恩诺沙星标准品的纯度均为98%,环丙沙星标准品和氧氟沙星标准品的纯度均为95%;乙腈和甲酸均为色谱纯;盐包,货号112-9670-111,内含6 g无水硫酸镁,1.5 g氯化钠。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温30 ℃;进样体积5μL;流量0.25 mL·min－1;流动相A 为1%(体积分数)甲酸溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～4.00 min时,A由90%降至70%;4.00～4.80 min时,A 由70%降至10%,保 持1.00 min;5.80～6.80 min 时,A 由10%升至90%,保持3.20 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源;毛细管电压4 000 V;干燥气温度300 ℃;干燥气流量10 L·min－1;雾化器压力13.8 k Pa;正离子模式,多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1。其中“*”代表定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

表1 (续)

1.3 试验方法

准确称取经粉碎后的鱼肉样品2.00 g 置于50 mL离心管中,依次加入100μg·L－1内标溶液200μL和水5 mL,涡旋1 min,然后加入提取剂含5%(体积分数,下同)乙酸的乙腈溶液10 mL,超声10 min。加入盐包(6 g无水硫酸镁,1.5 g氯化钠),剧烈涡旋1 min,以转速13 000 r·min－1离心5 min。将112-9669-368 型Sin-Qu ECh ERS 快速滤过柱垂直插入离心管内,缓慢向下按压净化柱的顶部,使得离心管内的上层有机提取液自下而上依次穿过净化柱内的阻水滤片和柱内净化填料,最终有机提取液进入到净化柱的储液槽内。用移液枪从储液槽内准确移取5 mL提取液置于15 mL离心管中,加入体积比1∶1的乙腈-正己烷混合液5 mL,混匀静置。取上层正己烷层涡旋1 min,以转速5 000 r·min－1离心3 min,弃去上层正己烷层,于40℃氮吹至近干,用0.2%甲酸溶液稀释并定容至1 mL,经0.22μm 滤膜过滤,供UHPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对质量浓度为10.00μg·L－1的混合标准溶液进行测定,结果见图1和图2。

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram

图2 选择离子色谱图Fig.2 Selective ion chromatograms

本方法在检测过程中未对样品进行彻底的色谱分离,而是选择节约时间的方式:选择三重四极杆质谱MRM 模式,采用1个母离子对应2个子离子的方式,对所测化合物进行了二次分离。将10.00μg·L－1的各单标准溶液分别重复进样12次,计算8种喹诺酮类药物和3种内标的2个定性离子丰度比的平均值,以国家标准对离子丰度比最大偏差允许值的范围要求[10]作为该化合物的抗干扰指标。结果显示:8种喹诺酮类药物和3种内标的离子丰度比均在要求范围内。

2.2 提取剂的选择

试验分别以乙酸乙酯、乙腈、含5%乙酸的乙腈溶液作为提取剂,考察了不同提取剂对8种喹诺酮类药物的提取效果。结果表明:乙酸乙酯对样品中的蛋白、脂肪等干扰物的溶解度较高,易造成严重的基质效应,而且在使用112-9669-368 型Sin-QuEChERS快速滤过柱净化过程中,提取液中的蛋白和脂肪容易堵塞净化柱,提取效率不佳,回收率在60.0%以下;乙腈对蛋白有很好的沉淀作用,可以有效去除鱼肉中的蛋白,降低基质对目标物的吸附,提高回收率[11-12],回收率在70.0%左右;喹诺酮类药物结构中都含有羧基和哌嗪基,属于两性化合物,易溶于酸性或碱性溶液,使用含5%乙酸的乙腈溶液为提取剂时,大大提高了8种喹诺酮类药物的提取效率,回收率为92.0%～108%。因此,试验选择含5%乙酸的乙腈溶液作为提取剂。

2.3 萃取盐包的选择

样品用水浸泡后再加入含5%乙酸的乙腈溶液提取,体系中含有大量水,将会严重影响喹诺酮类药物的提取效率和浓缩效率。在提取过程中加盐,可以达到很好的层析作用,使得水相和乙腈相得到较好分层,过饱和盐可以使目标物更好地溶解到乙腈层。试验最初选用常规盐包无水硫酸镁和无水氯化钠[13-17],但是加入无水硫酸镁后产生剧烈的放热现象,影响回收率,回收率在30.0%以下。而选择货号112-9670-111的盐包(内含6 g无水硫酸镁,1.5 g氯化钠),可直接加入,这不仅省去称量步骤,操作简单,而且回收率在80.0%～120%内,能达到测定要求。

2.4 净化方法的选择

试验分别对国家标准GB/T 21312－2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》中规定的固相萃取法、农业部1077号公告-1－2008《水产品中17 种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》中规定的液液萃取法和112-9669-368型Sin-Qu ECh ERS快速滤过柱的单步净化法进行了对比探讨。结果显示:液液萃取法操作费时、选择性差、消耗高纯溶剂过多,而且回收率较低,仅为30.0%～40.0%[18-20];国家标准GB/T 21312－2007 中规定的固相萃取法回收率较高,方法重复性好,但该净化过程需要活化、上样、淋洗、洗脱4个步骤,而且鱼肉样品基质较为复杂,上样期间容易堵塞固相萃取柱;而112-9669-368 型Sin-Qu ECh ERS快速滤过柱的单步净化法中直接将净化柱插进离心管内下压,上清液透过净化层上升,当下压至水面时,该柱子的下层渗透膜自动封闭,阻止水层通过,该方法有机试剂消耗量为10 mL,净化时间为1 mim,已然成为了未来检测的发展方向。因此,试验选择112-9669-368型Sin-Qu ECh ERS快速滤过柱的单步净化法。

2.5 溶剂效应

溶剂效应指溶剂对反应速率、反应平衡以及反应机理的影响。在高效液相色谱-串联质谱法中当样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会出现峰展宽、峰分叉的现象,进而造成分离度的降低[21]。分别选用50%(体积分数,下同)乙腈溶液和0.2%甲酸溶液作为溶剂进行对比,结果见图3。

由图3 可知,在同样的色谱条件下,当选用50%乙腈溶液作为溶剂时,会在1 min处出现一个峰,而且同样含量的目标物的响应值也低于0.2%甲酸溶液作为溶剂时的目标物的响应值。因此,试验选用0.2%甲酸溶液作为溶剂。

图3 不同溶剂下样品溶液的色谱图Fig.3 Chromatograms of sample solution in different solvents

2.6 标准曲线和检出限

将混合标准储备溶液逐级稀释,制得8种喹诺酮类药物的质量浓度为0.50,1.00,10.00,100.0,200.0,300.0,500.0μg·L－1的混合标准溶液系列,内标的质量浓度为100μg·L－1。按照仪器工作条件测定,内标法定量。以8种喹诺酮类药物的质量浓度为横坐标,以定量离子的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标,绘制标准曲线。所得线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

将1 000μg·L－1混合标准溶液稀释至0.50,1.00,10.00μg·L－1后依次添加至样品中,按照试验方法进样测定,以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

由表2可知:8种喹诺酮类药物的线性范围较宽,该分析方法运用的是三重四极杆质谱仪的MRM 模式,灵敏度较高,8 种喹诺酮类药物在500.0μg·L－1内基本都已达到峰饱和,质量浓度再高时线性关系较差,因此对于质量浓度较高的样品应该稀释进样;在本方法线性范围内,仅达氟沙星的相关系数为0.998 8,其余化合物的相关系数均大于0.999 0;检出限满足测定要求。

2.7 精密度试验

对实际样品进行了方法精密度试验,以保证测定结果的重复性[22-25]。按照试验方法测定同一样品,平行测定7次,测定值及其相对标准偏差(RSD)见表3。

表3 精密度试验结果(n=7)Tab.3 Results of test for precision(n=7)

由表3可知,8种喹诺酮类药物测定值的RSD为1.3%～6.3%,说明方法的精密度较好。

2.8 回收试验

按照试验方法对空白鱼肉样品进行3个浓度水平(2.00,6.00,20.00μg·L－1)的加标回收试验,计算8种喹诺酮类药物的回收率,结果见表4。

由表4 可知,8 种喹诺酮类药物的回收率为92.0%～108%,可满足方法测定的要求。

表4 回收试验结果Tab.4 Results of test for recovery

2.9 样品分析

按照试验方法对兰州市的4家大型超市中的黄花鱼、中华雄、桂鱼分别进行抽样测定,结果表明,8种喹诺酮类药物均未检出,说明目前抽查到的兰州市超市内流通的鱼肉产品不存在喹诺酮类药物残留问题。

同时,按照试验方法还对某复检机构下发的鱼肉盲样进行测定,并与农业部1077号公告-1－2008中方法的测定结果进行对比,结果见表5。

表5 不同方法比对结果Tab.5 Comparison of results by different methods

由表5可知,两种方法测定结果基本一致。

随着人们对餐桌食品的日益重视,药物残留问题已经成为人们茶余饭后的谈论话题,这无形中给食品检测机构带来了巨大压力。作为食品检测机构,不仅要满足国家限量要求的检测能力,更应该达到面对大批量样品时的快速检测能力。本工作提出的Sin-Qu ECh ERS一步净化技术结合超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼肉中喹诺酮类药物残留量的方法,成功解决了上述问题。该方法具有操作简单、试剂消耗量少、重复性好、选择性高[26-27]等优点,对鱼肉中喹诺酮类药物的测定有重要意义。方法还用于抽检兰州4家超市中3种鱼类,检测结果均为未检出,说明兰州市的鱼类食品中的药物残留问题相对安全。