可待因及福尔可定的密度泛函理论计算模拟和表面增强拉曼光谱测定

吴国萍,胡辰辰,陆腾,吴元钊

(1.江苏警官学院 刑事科学技术系,南京 210031;2.江苏省食品药品与环境犯罪检验技术工程实验室,南京 210031;3.中国科学院 计算机网络信息中心高性能计算技术与应用发展部,北京 100049;4.浙江警官学院 刑事技术系,浙江省毒品防控技术研究重点实验室,杭州 310051)

可待因(C18H21NO3)属于中枢性镇咳剂,镇咳效果显著,长期使用会形成药物耐受性,使人上瘾,国家药品监督管理局明确禁止18岁以下青少年儿童使用可待因药物。福尔可定(C23H30N2O4)属于依赖性镇咳剂,别名吗啉吗啡、福可定,由吗啡碱与氯化乙基吗啡啉合成而来,具有成瘾性和麻醉作用,虽国内还没有颁布相关的法律法规,一些西方国家已经禁止2岁以下儿童服用福尔可定镇咳剂。一些不法分子利欲熏心,私自在非依赖性镇咳剂中添加可待因和福尔可定以提高镇咳剂的功效。因此,加强镇咳剂中可待因和福尔可定的监测具有重要意义。

可待因、福尔可定的测定以液相色谱-质谱联用法[1]、高效液相色谱法(HPLC)[2-4]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[5]等实验室检测手段为主,快检方法还有酶联免疫法[6];近些年,拉曼光谱及表面增强拉曼光谱的研究方法发展迅速[7-26],但未见可待因、福尔可定的拉曼光谱及表面增强拉曼光谱相关研究报道。本工作首先通过密度泛函理论(DFT)方法对可待因、福尔可定进行几何构型优化,为标准品粉末的拉曼谱图及低浓度水平标准溶液的表面增强拉曼谱图的振动模式的指认和归属提供理论依据,并建立了这两种管制药品的表面增强拉曼检测方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

SSR-3010型便携式拉曼光谱分析仪;RMX 型手持式拉曼光谱仪;85-2 型磁力搅拌器;Vortex 3000型涡旋振荡器;HG202A-2 型电热鼓风干燥箱;Milli-Q Intergral 5型纯水机;Ymnl-P10H 型超声波清洗器;ME104E 型电子分析天平(感量0.1 mg)。

标准储备溶液:1.000 g·L－1,分别将适量的可待因标准品、福尔可定标准品用甲醇溶解,配制成质量浓度为1.000 g·L－1的标准储备溶液,于－18 ℃保存。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

可待因标准品的纯度96.9%,福尔可定标准品的纯度96.9%;柠檬酸钠、氯金酸、盐酸、硝酸、甲醇、氢氧化钠均为分析纯;试验用水为二次去离子水。

1.2 仪器工作条件

1)SSR-3010型便携式拉曼光谱仪 激光波长785 nm,功率275 m W,扫描范围为175～3 200 cm－1,分辨率为4.5 cm－1;激光器的激光发射功率500 m W,分辨率6 cm－1,积分时间10 s,积分2次,平滑度为1。

2)RMX 型手持式拉曼光谱仪 激光波长785 nm,功率350 m W。

1.3 试验方法

1.3.1 DFT 理论计算模拟

采用B3LYP/6-31G(d,p)混合基组对可待因、福尔可定体系进行几何构型优化,计算了体系的结构参数和拉曼光谱。使用VEDA4软件对拉曼谱图中特征峰的振动模式进行分析,将拉曼光谱的数据与VEDA4软件分析的简振模式数据结合,归属不同拉曼峰对应的振动模式,找出不同拉曼峰的产生原因。上述所有计算运用Gaussian09软件包完成。

1.3.2 拉曼光谱检测标准品粉末

将可待因及福尔可定标准品粉末置于洁净载物台上,调节测试点,用RMX 型手持式拉曼光谱仪分别扫描可待因及福尔可定标准品粉末,获取拉曼谱图及相关试验数据。

1.3.3 表面增强拉曼光谱检测低浓度水平的标准溶液

采用柠檬酸钠加热还原的方法[27-29]制得纳米金表面增强试剂,方法如下:移取1%(质量分数)氯金酸溶液2.00 mL,置于装有100 mL磁石和水的烧杯中,将溶液加热至沸腾,在磁力搅拌下于100℃加入1%(质量分数)柠檬酸钠溶液4 mL,溶液开始变黑,约1 min 变蓝,之后再加热,出现红色。煮沸2～3 min,溶液呈透明的酒红色,继续加热搅拌5 min左右,关闭磁力搅拌器,冷却至室温。将溶液放入棕色瓶中避光保存,得胶体金溶液,即为纳米金表面增强试剂。

调节被测溶液与纳米金表面增强试剂体积比、助剂种类(盐酸、硝酸)与用量、混合时间等检测条件,用SSR-3010型便携式拉曼光谱仪检测,确定最佳表面增强拉曼光谱检测条件:被测溶液100μL、纳米金表面增强试剂200μL、助剂16.7%(体积分数)硝酸溶液(即硝酸与水的体积比为1∶5)20μL、均匀混合10 s。

1.3.4 表面增强拉曼光谱定量检测方法摸索

以100 mg·L－1可待因、福尔可定标准溶液为母液,配制质量浓度均为10,20,30,40,50,60,70,80,90,100 mg·L－1的可待因、福尔可定标准溶液系列,按1.3.3节中确定的最佳条件进行系列表面增强拉曼光谱检测,以探讨其定量分析的可行性。

2 结果与讨论

2.1 分子的几何构型

可待因、福尔可定的结构如图1 所示。应用B3LYP/6-31G(d,p)混合基组对可待因、福尔可定进行结构优化和频率计算,优化后的分子构型如图2所示,在结果中未发现虚频的存在,说明优化得到的分子结构是稳定的。为了能详细表达分子的振动频率,对分子中每个原子前面加数字编号,如1C表示1号碳原子,8H 表示8号氢原子。

图1 可待因和福尔可定的结构Fig.1 Structures of codeine and pholcodine

图2 优化后的分子构型Fig.2 Optimized molecular configurations

2.2 可待因与福尔可定拉曼谱图解析

由图1和图2可知,可待因和福尔可定的结构大体相似,均为吗啡类似物,都具有左旋光性,福尔可定比可待因多一个1,4-氧氮六环(吗啡啉)。图3(a)从上而下分别是可待因DFT 理论计算模拟拉曼光谱图(简称DFT)、标准品粉末实测所得拉曼光谱图(简称EXP)及低浓度水平标准溶液的表面增强拉曼光谱图(简称SERS);图3(b)从上而下分别是福尔可定的DFT、EXP和SERS图。

由图3(a)和图3(b)中DFT 图可知:可待因DFT理论模拟主要特征峰位于288.00,376.00,424.00,496.00,624.00,656.00,688.00,888.00,1 072.00,1 136.00,1 192.00,1 240.00,1 280.00,1 304.00,1 360.00,1 400.00,1 496.00,1 536.00,1 632.00,1 664.00,1 688.00 cm－1等处;福尔可定比可待因多了1,4-氧氮六环(吗啡啉)结构,但可待因分子结构中也包含C－O、C－C 和C－N 等表征1,4-氧氮六环(吗啡啉)结构的主要键,因此福尔可定DFT 理论模拟拉曼光谱主要特征峰与可待因基本一致,主要特征峰位于280.00,322.00,344.00,432.00,632.00,784.00,864.00,952.00,1 032.00,1 080.00,1 120.00,1 168.00,1 184.00,1 232.00,1 248.00,1 304.00,1 336.00,1 376.00,1 488.00,1 520.00,1 632.00,1 672.00,1 688.00,1 696.00 cm－1等处,福尔可定在784.00,1 032.00 cm－1处的特征峰比可待因明显。

图3 典型拉曼光谱图Fig.3 Typical Raman spectra

由图3(a)和图3(b)中EXP 图可知:可待因和福尔可定标准品粉末实际检测的拉曼光谱图特征峰也是基本一致,但福尔可定特征峰的拉曼强度整体上大于可待因;可待因在911.10 cm－1处的特征峰拉曼强度明显高于福尔可定,福尔可定在775.78 cm－1和1 042.88 cm－1处的特征峰拉曼强度明显不同于可待因,这可能是由于它们具体化学环境不同产生的。

由图3(a)和图3(b)中SERS图可知:可待因和福尔可定直接进行拉曼检测时,拉曼效应非常弱,加入纳米金表面增强试剂后,400～1 800 cm－1附近分子整体的各种振动强度增强数个数量级,这可以理解为物理增强占主导的表面增强试剂对基底附近分子有增强的表现。可待因在355.50,530.13,596.00,814.00,936.67,1 263.02,1 435.18,1 595.26 cm－1等处的特征峰拉曼增强效果明显;福尔可定在355.50,530.13,628.58,816.60,1 251.41,1 444.02,1 601.59 cm－1等处的特征峰拉曼增强效果明显。

根据图3对可待因和福尔可定分子的拉曼光谱图进行振动模式与振动峰归属分析,结果见表1。

表1 可待因、福尔可定理论计算与实测拉曼光谱的特征峰波数与归属Tab.1 Theoretical and experimental wavenumbers of characteristic peaks and their assignments of codeine and pholcodine

由表1可知,实测的拉曼光谱吸收峰和表面增强拉曼光谱吸收峰主要集中在300～2 000 cm－1内,而2 000 cm－1之后的理论计算值中出现的峰都被较大的削弱了,如O－H、N－H 极性键在3 000 cm－1以上的特征峰几乎均消失。由图3和表1可知,大部分特征峰(如苯环的振动等)拉曼位移理论计算值、标准品实测值、表面增强实测值三者基本是一致的,但会有一定程度的蓝移和红移;可待因标准品粉末直接拉曼检测在1630.06,1 451.67,1 349.39,1 065.11,976.69 cm－1等处产生的特征吸收峰,在表面增强拉曼检测时蓝移至1 595.26,1 435.18,1 327.28,1 026.35,936.67 cm－1等处;福尔可定标准品粉末直接拉曼检测在1 624.10,1 469.52,1 341.07,1 042.88,944.17 cm－1等处产生的特征吸收峰,在表面增强拉曼检测时蓝移至1 601.59,1 444.02,1 327.28,1 026.35,936.67 cm－1等处。

2.3 表面增强拉曼检测条件优化及测定下限

调节被测溶液与纳米金表面增强试剂体积比、助剂种类(盐酸、硝酸)与用量、混合时间等检测条件,用SSR-3010型便携式拉曼光谱仪检测,确定最佳表面增强拉曼光谱检测条件,如1.3.3节中所示。在此条件下,对质量浓度在1～100 mg·L－1内的可待因、福尔可定标准溶液系列进行测定,结果发现,质量浓度低于10 mg·L－1时,可待因、福尔可定的特征峰拉曼强度减弱或消失比较明显。图4为质量浓度为10,100 mg·L－1的可待因、福尔可定标准溶液的表面增强拉曼比对谱图。

图4 10,100 mg·L－1的可待因和福尔可定标准溶液的表面增强拉曼光谱图Fig.4 SERS spectra of 10,100 mg·L－1 codeine and pholcodine standard solutions

结果表明:100 mg·L－1的可待因拉曼谱图各特征峰(355.50,530.13,596.00,631.29,698.37,814.00,936.67,1 263.02,1 327.38,1 435.18,1 513.97,1 595.26 cm－1)明显;当可待因质量浓度降低至 10 mg·L－1时,698.37,814.00,1 327.38 cm－1等处的特征峰消失;继续降低可待因质量浓度,特征峰消失的更为明显。同理,100 mg·L－1的福尔可定拉曼谱图各特征峰(355.50,527.36,598.72,628.58,798.42,816.60,936.67,1 251.41,1 327.38,1 441.82,1 601.59 cm－1)明显;当福尔可定质量浓度降低至10 mg·L－1时,虽然特征峰都能完整显现出来,但是拉曼强度大大降低;继续降低福尔可定的质量浓度,福尔可定的拉曼光谱图特征峰不再明显,甚至消失。因此,在此检测条件下,可待因、福尔可定的测定下限为10 mg·L－1。

2.4 可待因及福尔可定定量检测可行性探析

2.4.1 标准曲线

拉曼表面增强过程实际影响因素相当复杂,由于各基团所处化学环境不同,表面增强过程中各特征峰值强度随各浓度点变化情况各不相同,往往某一波数处的特征峰值强度与该浓度点线性关系不明显,因此本工作在系列数据定量分析处理过程中,寻找相对合适的两波数(波数1和波数2),以波数1与波数2 强度比作为相对强度,进行线性分析可行性探讨。按1.3.3节中确定的最佳表面增强拉曼光谱检测条件,对可待因、福尔可定标准溶液系列进行检测。可待因、福尔可定标准溶液系列的表面增强拉曼图谱如图5所示。

图5 可待因和福尔可定标准溶液系列的表面增强拉曼光谱图Fig.5 SERS spectra of codeine and pholcodine standard solution series

经大量数据对比,确定可待因的波数1为631.29 cm－1,波数2为1 595.26 cm－1;福尔可定的波数1为628.58 cm－1,波数2为1 251.41 cm－1。以可待因、福尔可定的质量浓度为横坐标,特征峰强度比值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:可待因、福尔可定标准曲线的线性范围均为40～100 mg·L－1,其线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性参数Tab.2 Linearity parameters

2.4.2 精密度和回收试验

以体积比为1∶1的甲醇-水混合液作为空白基质,在空白基质中添加可待因、福尔可定标准储备溶液,配制成加标量为50 mg·L－1的样品溶液,再进行回收试验。每个样品按1.3.3节中确定的最佳表面增强拉曼光谱检测条件平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。结果表明,可待因和福尔可定的回收率分别为99.0%～105%,102%～104%,RSD分别为5.3%,5.9%,说明所建立的方法精密度、准确度可满足拉曼快速检测需求。

由于表面增强拉曼光谱在增强过程中具有一定的偶然性,整体的可待因和福尔可定的线性关系不是很明显,因此本工作只是对可待因及福尔可定在一定的范围内进行线性关系可行性探讨,如果要深入探究可待因及福尔可定的定量检测可行性还需进一步研究。

本工作探析了可待因及福尔可定标准品粉末拉曼光谱特征峰的形成原因,并在最佳条件下,对样品测定下限进行摸索,同时研究了可待因和福尔可定低浓度水平系列标准溶液的表面增强拉曼检测效果。试验数据表明,可待因、福尔可定的测定下限为10 mg·L－1;可待因在631.29 cm－1和1 595.26 cm－1波数处、福尔可定在628.58 cm－1和1 251.41 cm－1波数处的特征峰强度比值,与其对应的质量浓度(40～100 mg·L－1)有相对较好的线性关系。当质量浓度低于40 mg·L－1时,线性关系不再明显,同时当可待因及福尔可定浓度高于100 mg·L－1时,浓度达到饱和,也不再具有良好的线性关系。可待因和福尔可定的表面增强拉曼测定方法的建立,为这两种管制药品提供了拉曼检测的理论依据和快检支持。