肉苁蓉美白霜处方优选及质量评价

吴亚男，于英杰，耿宏侠，张新悦，王宇佳，严德康，郭睿博，李学涛

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

肤色与多种生物色素的存在有关，这些生物色素有助于抵御太阳辐射，但决定肤色的最重要色素是黑色素[1]。黑色素在黑色素细胞中产生，该细胞中有一种溶酶体系细胞器，称为黑素小体，用来合成和储存黑色素[2]。黑色素的合成由L-酪氨酸启动，在酪氨酸酶的催化作用下经过多巴色素、多巴醌及多巴等一系列复杂的过程后生成黑色素。其中5，6-二羟基吲哚(5，6-dihydroxyindole，DHI)和5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)的含量比值决定了肤色由黑色到棕色的变化[3-4]。目前市场中的美白化妆品大多数均以酪氨酸酶为靶点，通过控制酪氨酸酶活性，从而降低黑色素的产生，以达到美白作用[5]。常用的皮肤美白添加剂种类有曲酸及其衍生物、果酸、维生素C等，但这些添加剂均存在一些不良反应。

肉苁蓉是一种传统中药，自古以来主要用于治疗男科疾病。其主要活性成分为苯乙醇苷[6]，在现代研究中，肉苁蓉提取物包括改善性功能、抗衰老、抗氧化[7]、提高学习记忆能力、神经保护、免疫调节、抗疲劳、抗缺血和肝保护等功能。此外，传统中药的提取物作为产品添加剂与现代美白产品中的化学添加剂相比，中药提取物具有皮肤亲和力好、安全可靠等优点。实验证明，苯乙醇苷可显著下调酪氨酸酶的活性[8]。因此，本研究以肉苁蓉作为主要成分，制备美白霜，并对其进行处方优选及质量评价，以期为开发肉苁蓉中的美白成分提供参考。

1 材料

1.1 实验试剂

十八醇；单硬脂酸甘油酯；PEG100硬脂酸酯；鲸蜡硬脂醇；乳木果脂；合成角鲨烷；丙二醇；吐温60；司盘60；甘油；卡波姆U30(均购于上海源叶生物科技有限公司)；肉苁蓉(产地内蒙古，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为正品)；毛蕊花糖苷标准品(批号：111530-201007，中国食品药品检定研究院)；氯仿、正丁醇、甲醇、甲酸、乙腈、硫酸、无水乙醇、磷酸均为分析纯试剂，水为纯净水。

1.2 实验仪器

FA1004型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；DZKW-S-4电热恒温水浴锅(上海医疗器械公司医疗器械五厂)；SG3300H型超声波清洗器(上海冠特超声仪器公司)；硅胶预制板G(批号：20110905，国药集团化学试剂有限公司)；C18色谱柱(月旭科技股份有限公司)。

2 方法与结论

2.1 美白霜制备

2.1.1 美白霜配方 十八醇0.3 g，单硬脂酸甘油酯0.5 g，PEG100硬脂酸酯0.25 g，鲸蜡硬脂醇0.1 g，乳木果脂0.75 g，合成角鲨烷1.25 g，司盘60 0.25 g，卡波姆U30 0.09 g，肉苁蓉提取物0.5 g，甘油2.0 g，丙二醇1.25 g，吐温60 1.0 g，三乙醇胺0.07 g。

2.1.2 美白霜制法 将十八醇、单硬脂酸甘油酯、PEG100硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇、乳木果脂、合成角鲨烷、司盘60置水浴锅上80 ℃加热熔融并混合均匀作为油相，卡波姆U30加水置水浴锅上80 ℃加热溶胀并溶解，加入肉苁蓉提取物，再加入甘油、丙二醇、吐温60并混合均匀作为水相，油相加入水相中，不断搅拌并乳化，并加入三乙醇胺搅拌均匀，放冷，即得肉苁蓉美白霜。

2.2 美白霜处方优选

选用正交试验筛选肉苁蓉美白霜的最优处方。根据美白霜的细腻度、光泽度、黏度、保湿度等方面进行综合评分，取其平均值，依据结果选出美白霜的最优处方。正交因素水平见表1。

表1 正交因素水平

由表2可确定，美白霜的最优处方为A2B1C2D3，即十八醇0.3 g，吐温60 1.0 g，司盘60 0.25 g，卡波姆U30 0.09 g。由表3可确定，对美白霜影响最大的因素为卡波姆U30，具有显著性差异。

表2 直观分析

表3 方差分析

2.3 理化性质检测

通过观察肉苁蓉美白霜的性状、细腻度，测定其酸碱度，并进行离心、低温和稳定性测试。将制备的样品置于-20 ℃条件下放置1 d，观察是否有分层、颗粒析出的现象[9]。在室温下连续放置30 d，观察其是否稳定，有无分层、颜色变化等现象。

按照“2.1.2”的方法制得的肉苁蓉美白霜为棕色霜剂，外观良好、细腻柔滑，在皮肤上涂抹无油腻感。测得pH为(6.90±0.05)，符合《中华人民共和国药典》要求，且通过观察离心后样品未出现油水分层现象。在-20 ℃放置1 d与室温条件下连续放置30 d均未出现分层、颜色变化等现象，制得的肉苁蓉美白霜表现出了较好的稳定性。

2.4 薄层色谱鉴别

精密称取肉苁蓉提取物1 g，加适量甲醇，于超声波清洗器中超声15 min，过滤后，蒸干水分至近干状态，甲醇溶解，即得对照药材溶液。取空白基质、肉苁蓉美白霜各0.5 g，加入甲醇，超声溶解，离心，取上清液，分别作为阴性溶液和供试品溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一薄层板上，以氯仿6∶正丁醇1∶甲醇2∶甲酸2的比例配置展开剂进行展开[10]，取出后晾干，喷以10%的硫酸乙醇，在105 ℃下加热至斑点清晰。由图1可知，肉苁蓉美白霜的薄层色谱斑点清晰，专属性强，空白基质无干扰。

2.5 毛蕊花糖苷含量测定

2.5.1 色谱条件[11]色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.5.2 溶液制备 ①供试品溶液制备。精密称取制得的肉苁蓉美白霜0.5 g，加甲醇适量，超声溶解15 min(40 kHz)，过滤后于10 mL容量瓶中定容，即得供试品溶液。②对照品溶液制备。精密称取毛蕊花糖苷对照品4.13 mg，置100 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀，即得对照品溶液。③阴性溶液制备。精密称取制得的空白基质0.5 g，加甲醇适量，超声溶解，过滤后10 mL容量瓶中定容，即得阴性溶液。以上溶液均经0.45 μm微孔滤膜滤过。

注：1.对照药材；2.空白基质；3、4、5肉苁蓉美白霜。

2.5.3 系统适应性考察 分别取供试品、对照品、阴性溶液按“2.5.1”项下色谱条件进行测定。供试品与对照品中毛蕊花糖苷出峰时间相近，阴性溶液未见该峰，说明专属性良好，阴性溶液对其无干扰。见图2。

2.5.4 线性关系考察 吸取毛蕊花糖苷对照品溶液，制成6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的标准品溶液，在“2.5.1”项下色谱条件进行测定，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，即得线性回归方程y=28 483x+54 316(R2=0.999 4)，表明毛蕊花糖苷在6.25～200 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

2.5.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，即得毛蕊花糖苷的峰面积RSD为1.58%(n=6)，表明仪器精密度良好。

图2 毛蕊花糖苷含量测定的HPLC

2.5.6 重复性试验 精密吸取供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，即得毛蕊花糖苷的峰面积RSD为1.81%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.5.7 稳定性试验 精密吸取于室温下放置0、4、8、12、20、24 h的供试品溶液，进行测定，即得毛蕊花糖苷的峰面积RSD为1.04%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.8 加样回收率试验 精密吸取9份已知含量的供试品溶液，加入等量毛蕊花糖苷对照品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，结果见表4。

表4 毛蕊花糖苷加样回收率试验结果

2.5.9 含量测定 精密称取肉苁蓉美白霜9份，每份0.5 g，按“2.5.2 ①”方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定。结果见表5。

表5 毛蕊花糖苷含量测定结果 (mg/g)

3 讨论

尽管许多酶参与了黑色素的生成过程，但酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1(Tyrosinase-related protein-1，TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(Tyrosinase-related protein-2，TRP-2)在黑色素合成中起着重要作用。具体来说，酪氨酸酶在催化黑色素合成中起到限速作用，是黑色素合成抑制剂发展的最重要途径。已知的黑色素沉着由超过125个不同的基因调控[12]。这些基因调控着黑色素细胞一些重要的生物学功能，如细胞分化以及调节色素沉着或黑色素生成。其中，小眼转录基因(Microphthamia transcription factor，MITF)是已知黑色素细胞发育转录因子中最重要的成员[13]。MITF通过绑定TYR、TRP-1、TRP-2 三种基因表达的启动因子区域，从而调节其转录过程[14]。肉苁蓉苯乙醇苷能够降低黑色素含量，显著抑制TYR、TRP-1基因的转录水平，并能下调TYR、TRP-1和TRP-2的蛋白表达。此外，肉苁蓉苯乙醇苷也可抑制MITFmRNA转录水平，下调MITF的蛋白表达[15]。

我国对美白化妆品的需求量逐年递增，但目前大多数化妆品中的有效成分通常有有害成分，我国中药资源丰富，且安全性高，因此，本研究采用肉苁蓉为原料，制备美白霜。所制得的美白霜外观良好、细腻柔滑、性质稳定，在皮肤上涂抹无油腻感，亲肤力较强；对其进行理化性质检测，检测结果表明其稳定性良好。正交试验设计具有方法科学、操作简便、效果显著的优点，因此，选用正交试验筛选肉苁蓉美白霜的最优处方，确定的最优处方为十八醇0.3 g，吐温60 1.0 g，司盘60 0.25 g，卡波姆U30 0.09 g。通过方差分析确定对美白霜影响最大的因素是卡波姆U30。利用高效液相色谱法测定毛蕊花糖苷含量简单可行、重现性好、精密度高、结果可靠，可用于测定肉苁蓉美白霜中毛蕊花糖苷的含量。