银屑平丸联合阿维A胶囊对银屑病样小鼠模型的疗效及IL-17、IL-23的影响

鲍秋羽，席建元

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410208)

银屑病(Psoriasis，PS)是一种由免疫所介导的以红色斑块并覆有鳞屑为主要临床表现的慢性、炎症性皮肤病[1]。中医学属“白疕”范畴。流行病学调查显示，1990-2017年间，我国银屑病患病率呈现持续增长的趋势，至2017年，银屑病患者人数已达800多万，较1990年增长了1.95倍[2]。该病除致皮肤症状外，还可能出现关节疼痛不利，伴有糖尿病、肥胖以及心脑血管等疾病，严重影响着患者的身心健康[3，4]。因此，银屑病一直是皮肤病研究领域的热点之一[5]。银屑病的病理表现为表皮中角质形成细胞的异常增生及分化，伴随有皮肤血管异常增生以及炎症细胞的浸润[6，7]。该病的发病机制与遗传、免疫、环境、感染等因素相关，但尚未完全明确[8]。有研究表明，银屑病的发生发展与T细胞、巨噬细胞等及其所分泌的细胞因子之间有复杂的联系。IL-23在机体免疫中主要发挥着致炎效应，可诱导产生TNF-α，并放大炎症反应[9]。IL-17可促进Treg细胞分裂增生，可有效抑制Th17细胞的增生分化，达到抑制炎症反应的目的[10]。因此，对IL-17和IL-23在银屑病发病进程中产生的机制深入研究，或成为银屑病治疗的突破点。前期研究发现，银屑平丸治疗PS疗效显著，且不良反应少[11]。本实验拟采用咪喹莫特乳膏制造BALB/c小鼠PS模型，进一步探讨银屑平丸治疗PS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF清洁级雌性BALB/c小鼠40只，体质量18～20 g，8～12周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证号：SCXK(湘)2019-0004)。将小鼠置于中南大学湘雅医学院动物实验中心(温度控制在(21±3) ℃、相对湿度保持在40%～70%饲养，小鼠饲料及可用饮水均由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。所有小鼠在实验前予以5天的适应性喂养，且实验全程按照动物伦理学标准进行。

1.2 实验药物

银屑平丸为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，由我院制剂室提供(批号：20201204，规格：60 g/瓶)；阿维A胶囊(重庆华邦制药有限公司生产，国药准字号：H20010126，规格：10 mg)；5%咪喹莫特乳膏(四川明欣有限公司生产，国药准字号：国药准字H20030129，规格：3 g：0.15 g，3 g/支)；白凡士林(南昌白云药业有限公司生产，赣食药准字：F20050006，规格：500 g)。

1.3 主要试剂与仪器

PBS(美国Hyclone，货号：80334412)；酶联免疫吸附试验(ELISA)IL-17、IL-23试剂盒(武汉博士德生物，货号分别为：EK0866、EK1364)；酶标仪：深圳汇松(型号：MB-530)。

1.4 动物分组

通过随机数字表分组法将40只小鼠分为5组，包括空白对照组、模型组、阿维A胶囊组、银屑平丸组、阿维A胶囊+银屑平丸组(中西结合组)，每组8只小鼠。

1.5 PS小鼠模型的建立

实验前将40只小鼠通过戊巴比妥钠腹腔注射进行药物麻醉(80 mg/kg)，随后使用动物专用剃毛仪给麻醉后实验小鼠清除背部白毛，充分暴露背部皮肤以外涂药物造模，面积约3 cm×4 cm大小，其中空白对照组小鼠使用凡士林造模，其他各组小鼠使用5%咪喹莫特乳膏造模，1次/天，连续外用8天。

1.6 动物给药

依据银屑平丸临床药量标准，每人每日服用药量为0.75 g/kg，根据人与实验小鼠体质量比例计算，本研究中用量与临床等效剂量相当，设定为6.49 g/kg/d。同公式换算可得出阿维A胶囊组的临床等效量为6 mg/kg/d。使用生理盐水加热充分溶解银屑平丸粉剂及阿维A胶囊粉剂制备实验所用药液。外用药物造模同时，空白对照组以及模型组小鼠灌胃生理盐水0.4 mL；阿维A胶囊组小鼠灌胃阿维A药液0.4 mL；银屑平丸组小鼠灌胃银屑平丸药液0.4 mL；每组小鼠每天灌胃1次，连续用药8天。

1.7 动物取材

实验第8天24 h后，每只小鼠在眼球处取血1.0 mL，随即将血液置于4 ℃的低温下离心1 500转/min共5 min，并立即抽吸上层血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于检测本次实验的炎性细胞因子IL-17、IL-23。后续断颈处死每只小鼠，使用无菌仪器在小鼠造模处留取皮肤组织，面积约1 cm×1 cm左右，分组固定保存于已序号标记的福尔马林溶液中，脱水后石蜡包埋，然后切片，进行HE染色。

1.8 指标观察

观察每组小鼠皮损变化并予以皮损面积及严重程度指数(Psoriasis area and severity index，PASI)评分，酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测各组小鼠血清IL-17、IL-23的表达水平，HE染色观察各组小鼠的皮肤病理改变。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠形态学观察及PASI评分情况

密切观察各组小鼠造模后的皮损情况，在第8天后可见模型组小鼠皮损处出现红斑、大量鳞屑，且皮疹较为肥厚，表现为银屑样改变；阿维A胶囊组、银屑平丸组、中西结合组小鼠皮损均有不同程度的缓解，其中中西结合组小鼠皮损改善最明显，具体见图1。与空白对照组相比，模型组、阿维A胶囊组、银屑平丸组、中西结合组小鼠背部皮损的PASI评分均显著升高(P<0.05)；与模型对照组相比，阿维A胶囊组、银屑平丸组、中西结合组小鼠背部皮损的PASI评分均显著降低(P<0.05)，其中中西结合组疗效最佳(P<0.05)，具体见表1。

注：A：空白对照组；B：模型组；C：阿维A胶囊组；D：银屑平丸组；E：中西结合组。

表1 各组小鼠PASI评分情况 分)

2.2 各组小鼠皮损组织病理学改变

各组小鼠皮损组织HE染色结果显示，空白对照组皮肤组织结构较完整，可见清晰的角质层、颗粒层及基底层；模型组皮损组织可见明显的角质层断裂，大量的皮肤乳头水肿。阿维A胶囊组、银屑平丸组、中西结合组视野下可见角质层断裂存在不同程度的改善，其中中西结合组改善程度较为明显。具体见图2。

2.3 各组小鼠血清炎性因子表达水平

ELISA结果显示，阿维A胶囊组、银屑平丸组、中西结合组小鼠血清IL-17、IL-23表达水平均显著降低，其中中西结合组效果最佳(P<0.05)。具体见表2。

表2 各组小鼠血清IL-17、IL-23表达水平

注：A：空白对照组；B：模型组；C：阿维A胶囊组；D：银屑平丸组；E：中西结合组。

3 讨论

研究表明，银屑病的发病机制主要与机体免疫相关，T淋巴细胞贯穿银屑病病程的始终，T淋巴细胞可通过分泌不同的细胞因子，包括IL-17、IL-23、TNF-α等[12]。这些炎症因子促使角质形成细胞不断增殖分化产生鳞屑性斑块，刺激血管不断增殖、扩张，并使炎症细胞浸润而形成红斑[13]。研究显示，Treg细胞与Th17细胞之间关系失衡可能是银屑病发病的新线索，在银屑病患者的皮损中，Th细胞及其细胞因子较正常人群增加，而Treg细胞及其细胞因子则相对有所减少，其中Treg细胞在皮肤中能免疫耐受共生微生物，抑制炎症的发展[14]。IL-17、IL-23均为T淋巴细胞所分泌，若阐明IL-17、IL-23炎症因子在银屑病发病过程中的作用，可能为银屑病治疗的新方向。

中医学对银屑病病因的认识最早可追溯至隋代，隋代医家巢元方在《诸病源候论》中认为“干癣”以外感风邪为主因，夹杂寒湿之气合而入里，侵袭人体肌腠，凝滞气血，气血失畅而为病，开创了银屑病外邪致病的先河。唐宋医家继承并发展银屑病外邪致病理论，唐代王焘在《外台秘要》、宋代赵佶在《圣济总录》中均有提及[15]。湖南中医药大学第一附属医院席建元教授根据该病的病因病机，结合多年临床经验创立“凉血养阴，清热解毒”的治疗原则，并研发出银屑平丸，长期临床运用，广受患者好评[16-17]。该药物由生地黄、牡丹皮、紫草、丹参、白花蛇舌草、半枝莲、大青叶、赤芍、防风、女贞子、旱莲草、甘草组成。方中君药生地黄甘而苦寒，以寒之性凉解血热，养阴之效顾护津液，使邪气祛除不损正气；赤芍、丹皮、丹参味苦性微寒，均以血治，达肝经清郁滞之火毒，入血分清蕴结之瘀热，凉解血热又能消散瘀血，防止热与血结；紫草甘寒同入血分，清解血分热毒，透泄斑疹；白花蛇舌草酸凉，半枝莲、大青叶苦寒，三药相合，清泄血热，凉解火毒，专攻火热毒盛，共为臣药。血热内蕴，煎熬津液，津伤不能濡润肌肤，女贞子、墨旱莲互为佐药入肝肾以滋养肝肾之阴，益下荣上，养阴润燥以生津化液荣养肌肤。防风辛散驱邪外出，且为治风润药，功善疏风止痒；甘草善清热解毒调和诸药，与防风共为使药，诸药相合，共奏凉血养阴、清热解毒之功。

本研究显示，银屑平丸联合阿维A胶囊可明显改善PS小鼠模型的皮损情况，均较单独使用银屑平丸或阿维A胶囊疗效更佳，作用机制可能与抑制PS小鼠模型血清IL-17、IL-23炎性因子表达水平相关，但其深入机制仍需进一步的实验研究予以阐明。