重楼皂苷Ⅶ对K562细胞增殖和凋亡的作用机制研究

朱红波，谭莉明，李彩余，周卫华

（1.山东第一医科大学第二附属医院血液内科，山东泰安 271000；2.吉首大学医学院护理教研室，湖南吉首 416000；3.湘西自治州人民医院产前诊断中心，湖南吉首 416000）

白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，在人类恶性肿瘤发病率中居第六位[1]。与实体瘤不同，血液系统恶性肿瘤不能通过手术或放射治疗治愈，其他新兴疗法也难以普及，如干细胞移植存在匹配困难等问题，只能用于少部分患者[2]。因此，化疗仍是白血病的主要治疗方法，但其不良反应和耐药性已成为化疗的主要障碍。K562细胞系是费城（Ph）染色体阳性的多能前体细胞，最初来源于急变期末期慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）患者[3]；该细胞系是非贴壁的、圆形的、高度未分化的，具有活跃的增殖能力和抑制细胞凋亡的作用。研究表明，中药中的活性成分通过诱导细胞分化和凋亡，在白血病治疗中发挥显著作用[4-6]。因此，恶性造血细胞可能对以凋亡和分化信号通路为靶向的治疗特别敏感。探索新型治疗药物及其分子机制对改善CML患者的预后具有重要意义。

植物来源的化合物相对于化疗、手术和放射疗法具有较高成本效益，且毒性较低，并能通过不同的途径抑制肿瘤。百合科植物重楼，又名七叶一枝花，作为一种中草药被用于癌症治疗[7-8]。重楼抗肿瘤的主要成分是甾体皂苷。重楼皂苷Ⅶ（PP7）为重楼抗肿瘤活性物质的有效成分之一，具有较强的抗癌活性；研究证实PP7可以通过线粒体和死亡受体途径诱导SW-480细胞凋亡并将SW-480细胞周期阻滞于G1期[9]。PP7能够抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，并可能通过下调PD-L1表达诱导PANC-1细胞凋亡[10]，但重楼皂苷Ⅶ在白血病中的抗肿瘤作用未见报道。本研究旨在通过PP7作用于K562细胞来探讨PP7对白血病肿瘤细胞的抑制作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、实验药物和试剂 细胞株K562购自中国科学院上海细胞库，传代培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，5%CO2、37 ℃条件下培养。重楼皂苷Ⅶ（上海纯优生物科技有限公司分子式C51H84O22，纯度＞98 %，分子量为1 049.2）；细胞增殖活性试剂盒（CCK-8）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，Annexin-Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 CCK-8检测PP7对K562细胞增殖的影响 将呈指数生长的K562（1.3×105/mL）接种到96孔板的孔中，分别加入浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L的PP7，在空白对照孔中加入等体积的DMEM培养基作空白对照。每个浓度设5个重复，每孔总体积为100 μL。将不含PP7但具有相同浓度(＜0.1%)二甲基亚砜（DMSO）的细胞用作对照组(0 μmol/L)。细胞孵育24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8。在CO2培养箱孵育2 h，使用BioRad M450酶标仪测量450 nm波长处的光密度(A)。每个实验重复3次，细胞增殖抑制率（CVIR）按下式计算：CVIR=（1－实验组A450平均值/对照组A450平均值）×100%，为进一步实验选择最佳PP7浓度。

1.3 荧光素标记磷脂酰丝氨酸/碘化丙啶（Annexin-Ⅴ-FITC/PI）试剂盒检测PP7对K562细胞凋亡的作用 K562细胞以1.5×105/mL的密度接种于6孔板中，并用不同浓度的PP7处理24 h，使用Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染色通过流式细胞术测量检测细胞凋亡情况。将细胞重悬于100 μL结合缓冲液中，加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，轻轻混合，将细胞在室温下避光孵育15 min，然后加入缓冲液500 μL。在1 h内使用BD FACSCantoII流式细胞仪进行检测，每个实验重复3次。

1.4 免疫印迹法（Western Blot）检测Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白表达改变 收取PP7处理过K562细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。通过RIPA裂解缓冲液提取总细胞蛋白。并使用Bradford试剂测定蛋白质浓度。根据蛋白质电泳的常规方法制备凝胶和样品，并将蛋白质转移到膜上。兔抗人Caspase-9、Bcl-2、Bax和GADPH抗体（上海生工生物工程有限公司），膜孵育过夜。漂洗后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶2 000），将膜在振荡器上孵育2 h。最后，加入化学发光试剂用于成像。

1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行数据处理。计量资料以（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较行Tukey法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PP7对K562细胞增殖抑制率的影响 随着PP7浓度的增加，K562细胞的生长逐渐减弱，PP7对细胞生长的抑制呈浓度依赖性，见表1。

表1 PP7对K562细胞增殖抑制率的影响（）

表1 PP7对K562细胞增殖抑制率的影响（）

PP7浓度(μmol/L) 细胞总抑制(%)0.5 41.32±5.03 1.0 56.03±6.01 2.0 82.36±6.12 4.0 91.34±3.01 8.0 96.73±1.89 F值 125.88 P值 0.002

2.2 PP7对K562细胞凋亡的影响 Annexin-V/PI染色法定量检测PP7对K562细胞引起凋亡的作用。结果表明，随着PP7浓度的增加，K562细胞凋亡的比例逐渐增加，见表2、图1。

表2 PP7对K562细胞凋亡影响（）

表2 PP7对K562细胞凋亡影响（）

PP7浓度(μmol/L) 细胞总抑制(%)空白组 15.74±3.12 0.5 43.16±6.08 1.0 64.32±7.03 2.0 91.74±3.05 F值 357.29 P值 0.007

图1 不同浓度PP7诱导K562细胞凋亡情况

2.3 Western blot检测结果 通过Westernblot研究PP7处理K562细胞中凋亡相关蛋白的表达。蛋白质印迹结果显示，各浓度的PP7都导致Caspase-9裂解的水平显著增加，见图2。随着PP7浓度的增加，抑制Bcl-2表达的作用越明显，而凋亡蛋白之一的Bax的表达显著增加。

图2 各浓度PP7对K562细胞蛋白表达的影响

3 讨论

天然产物已被证明是抗肿瘤药物开发的可靠来源。PP7是一种天然的皂苷衍生化合物，存在于中草药重楼的根茎组织中[11]。PP7具有抗炎[12]、止血镇痛[13]、免疫调节[14]等药理作用，且不良反应小，已被广泛应用于临床。最近有研究显示，PP7在各种癌细胞系中诱导细胞凋亡，并在体内具有抗肿瘤活性，如肺癌和卵巢癌[15]。PP7可通过抑制P-糖蛋白和诱导细胞凋亡来抑制化疗耐药性乳腺癌的生长并逆转MCF-7/阿霉素耐药细胞的多药耐药性。PP7降低基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的活性，提高A549肺癌细胞中金属蛋白酶的表达。PP7可通过p38 MAPK信号通路抑制MMP-2和MMP-9的产生来抑制迁移和侵袭。PP7可显著抑制H460细胞增殖,影响其集落形成，并使细胞形态发生变化，抑制细胞体外的迁移和侵袭能力，并可诱导凋亡的发生。这说明PP7具有导致肿瘤细胞线粒体功能紊乱的作用，通过调节癌细胞中的几种信号通路来诱导细胞凋亡。本研究结果表明，PP7抑制K562细胞的生长，并且该抑制作用与药物浓度呈正相关。诱导凋亡可能是PP7抑制K562细胞生长的机制，通过该机制可以在K562细胞中发挥PP7的抗增殖活性。本研究证明K562细胞凋亡受PP7处理的影响，0.5～2 μmol/L PP7处理24 h后，K562细胞凋亡率显著增加。

线粒体不仅是细胞内能量产生的关键细胞器，也是细胞信号转导的平台，在细胞信号转导、细胞增殖、分化、自噬和细胞免疫中起着至关重要的作用。线粒体是动态的细胞器，其分裂和融合的不平衡导致结构变化和功能障碍。细胞内有两种主要的凋亡途径：外在（死亡受体途径）和内在（线粒体途径）。线粒体介导的内在凋亡途径的激活受Bcl-2家族蛋白控制，是抗肿瘤药物功能中涉及的关键机制之一。Bcl-2是细胞凋亡途径中的上游效应分子，已被确定为细胞凋亡的有效抑制因子[16]。Bax/Bcl-2调节细胞色素C（Cyt C）从线粒体释放到细胞质中，细胞质中的Cyt C启动Caspase级联反应（如Caspase-3/9），导致细胞凋亡[17]。PP7处理K562细胞后，Bcl-2表达明显受到抑制，Bax表达得到促进，因此，Bax/Bcl-2显著增加。半胱天冬酶级联的激活也在线粒体凋亡途径中起关键作用。Caspase-9是内在途径中Caspase级联反应的关键起始蛋白，本研究结果显示，PP7以浓度依赖性方式显著增加裂解的Caspase-9的表达。这提示用PP7处理的K562细胞是通过线粒体所调节的内在凋亡途径而受到抑制。

综上，本研究为PP7在抗CML细胞中抗肿瘤活性中的作用提供了实验证据，PP7具有成为临床治疗慢性粒细胞白血病有效药物的潜力。