纤维素酶法提取无患子皂苷的工艺优化

彭怡心，符春花，王亚，吴泽君

（株洲市食品药品检验所，湖南 株洲 412000）

无患子皂苷为天然的非离子型表面活性剂，具有很强的降低表面张力的作用［1］，泡沫丰富、手感细腻、去污力强、易降解、对皮肤刺激性小，是洗发香波、化妆品以及各种生物洗涤剂的优良原料［2］。同时无患子皂苷还具有抗细菌、抗真菌、杀虫、抗炎、抗肿瘤、保肝等功效［3］，对人体皮肤有抗菌、杀菌和消炎作用，还有去屑止痒功效，经科学纯化处理的无患子洗洁产品还具有泡沫丰富、柔嫩肌肤、增白祛斑、祛痘、防治皮肤病等特点［4，5］。因此，无患子皂苷在医药及日化领域的价值倍受重视，具有广阔的市场前景。

目前关于无患子皂苷提取方式主要包括溶剂浸提、超声提取、酶提取、微波提取等［6-17］，其中大部分采用有机溶剂提取法，虽然杂质含量较水提法低，但成本较高，易引起环境和安全问题。酶具有高效性和特异性，可改变植物细胞壁的通透性，有利于活性成分的溶出［18，19］，魏凤玉等［20］发现纤维素酶有助于无患子皂苷的提取，提取率比未加酶处理时提高了19.63%。郑林禄等［21］采用复合酶提取无患子皂苷，得出当复合酶质量浓度0.6 mg/mL，酶解温度50℃，pH 4.5，酶解时间2.5 h时，提取率为64.40%。因此从环保和经济的角度考虑，本研究以水为溶剂，采用纤维素酶解法首次分粒度提取无患子皂苷，并以高效液相色谱法测定及计算皂苷的提取率，优化了粒度较大无患子粉末的提取工艺，有效提高了皂苷的提取率并节约了资源和成本，同时探究了不同纤维素酶对不同粒度无患子皂苷提取率的影响，为无患子皂苷的工业化生产和原料粒度分级提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

纤维素酶（酶活力≥15 000 U/g）、无水乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）均为国药集团化学试剂有限公司生产；纤维素酶RS（酶活力16 000 U/g），北京拜尔迪生物技术有限公司；纤维素酶（酶活力50 U/mg），上海源叶生物科技有限公司；无患子果皮粉，湖南省仙泉自然生物科技有限责任公司。

试验仪器：药典筛，浙江上虞市五四仪器厂；XSE105DU型电子分析天平，梅特勒-托利多国际贸易有限公司；SHY-2A型水浴恒温振荡器，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；HWS12型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；医用离心机，湖南平凡科技有限公司；Utimate 3000 HPLC，赛默飞世尔科技中国有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理取无患子果皮粉碎后分别过1-2号筛（过1号筛、不能通过2号筛），2-3号筛（过2号筛、不能通过3号筛），3-5号筛（过3号筛、不能通过5号筛），大于5号筛（全部通过5号筛）得到4组不同粒度的无患子粉末。

1.2.2 无患子皂苷的提取称取不同粒度的无患子粉末，用去离子水作为溶剂以1∶10固液比置于50 mL离心管中，加酶后于一定温度的水浴恒温振荡器中酶解一定时间，每隔0.5 h振摇20 s，转速100 r/min。将离心管置于80℃恒温水浴锅灭酶30 min，8 000 r/min离心10 min后吸取上清液即为无患子皂苷水提液。

1.2.3 标准曲线的制作准确称取自制无患子皂苷对照品（分离纯化的部分物质）0.04 g用甲醇溶解并定容至10 mL，稀释得到0.05、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/mL浓度的皂苷标准系列溶液，按照液相色谱条件：色谱柱Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30℃；流动相：A为水，B为乙腈，洗脱梯度见表1；流速1 mL/min；检测波长205 nm进行测定。以峰面积为纵坐标，无患子皂苷对照品质量浓度（mg/mL）为横坐标制作标准曲线，建立皂苷含量的回归方程y=50.276x-0.671 1，R2=0.999 4。

表1 洗脱梯度

1.2.4 无患子皂苷提取率的计算取“1.2.2”中的无患子皂苷水提液用无水乙醇稀释5倍，离心后吸取上清液用“1.2.3”中液相色谱方法测定峰面积，根据标准曲线得出测定液中无患子皂苷的浓度，皂苷提取率计算公式如下。

式中，w表示无患子皂苷提取率（%）；c表示测定液中无患子皂苷的浓度（mg/mL）；v表示提取液的体积（mL）；m表示无患子粉末质量（g）；f表示稀释倍数。

1.2.5 统计分析每组试验重复3次，采用SPSS Statistics 22软件进行数据分析，Origin 2019软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同纤维素酶对不同粒度无患子皂苷提取率的影响

将北京拜尔迪生物技术有限公司、上海源叶生物科技有限公司、国药集团化学试剂有限公司生产的纤维素酶按照同一酶活定义换算酶活单位后，按照6、15 U/mL分别加入4组不同粒度的无患子粉末中，50℃酶解2 h，同时做空白试验，考察不同纤维素酶对不同粒度无患子皂苷提取率的影响。由图1可知，拜尔迪纤维素酶对2-3号筛、3-5号筛、大于5号筛无患子粉末的皂苷提取率有促进作用，对1-2号筛的粉末无明显影响。酶活浓度为15 U/mL时2-3号筛粉末的皂苷提取率从2.83%提高至3.21%，提高了13.4%，3-5号筛无患子皂苷提取率从3.42%提高至4.22%，对大于5号筛的粉末皂苷提取率也有明显提高。

图1 拜尔迪纤维素酶对不同粒度无患子皂苷提取率的影响

由图2可知，上海源叶纤维素酶提高了1-2号筛、2-3号筛、3-5号筛无患子粉末的皂苷提取率，而对更细的粉末促进作用不明显。6 U/mL和15 U/mL酶活浓度使1-2号筛粉末的皂苷提取率分别提高了7.09%和8.96%，使2-3号筛无患子皂苷提取率从2.83%分别提高至3.04%和3.06%，提高了7.42%和8.13%，同时15 U/mL酶活浓度还将3-5号筛的皂苷提取率提高了19.3%。

图2 上海源叶纤维素酶对不同粒度无患子皂苷提取率的影响

由图3可知，国药纤维素酶对1-2号筛、2-3号筛、3-5号筛无患子粉末的皂苷提取率有明显促进作用，对更细的大于5号筛的粉末几乎无影响。15 U/mL酶活浓度将1-2号筛无患子皂苷提取率提高了13.1%，将2-3号筛粉末皂苷提取率提高了13.4%，同时6、15 U/mL的纤维素酶活浓度还使3-5号筛粉末提取率分别提高了16.1%和20.8%。

图3 国药纤维素酶对不同粒度无患子皂苷提取率的影响

综上可知，由于无患子皂苷工业化提取时考虑成本、能耗等因素对原料的粉碎程度不会特别高，大多数为最粗粉或粗粉级别，即1-2号筛、2-3号筛粉末，少数为3-5号筛级别，国药纤维素酶对前2种粒度无患子粉末的皂苷提取率提高得最明显，同时对更细的3-5号筛粉末促进作用较明显，因此选国药纤维素酶和1-2号筛、2-3号筛粉末做下一步试验。同时可以看出粒度越小的无患子粉末皂苷提取率越大，当粉末粒度均大于5号筛时纤维素酶对无患子皂苷的提取率几乎无影响或促进作用较小，说明无患子果皮粉碎的越细，越有利于皂苷的提取，当植物细胞粉碎的很细时极大促进了皂苷的溶出从而使酶的破壁作用不明显。因此，对于无患子皂苷工业化提取时，原料粉末加酶提取可选择国药的纤维素酶，而对原料粒度大于5号筛时，考虑成本因素可不加纤维素酶提取，这为无患子皂苷工业化提取的粒度分级提供了参考。

2.2 纤维素酶添加量对无患子皂苷提取率的影响

在纤维素酶添加量分别为0、3、6、12、18、24 U/mL时，50℃条件下提取2 h，考察加酶量对1-2号筛、2-3号筛无患子粉末皂苷提取率的影响。由图4可知，随着纤维素酶活浓度的增加，1-2号筛粉末的皂苷提取率逐步提高，至18 U/mL时提取率显著提高且达到最大，从2.79%提高至3.15%，之后随着酶添加量的增加，皂苷提取率无显著变化，因此对1-2号筛无患子粉末皂苷提取的最佳酶活浓度为18 U/mL。对2-3号筛无患子粉末随着酶活浓度的提高，皂苷提取率整体呈上升趋势，至12 U/mL时提取率显著提高，从2.82%提高至3.24%，再增加酶的浓度虽然有所提高但考虑成本因素，酶活浓度12 U/mL最合适。

图4 酶添加量对1-2号筛、2-3号筛无患子皂苷提取率的影响

综上分析，对最粗粉（1-2号筛）和粗粉（2-3号筛）而言，在无患子皂苷提取时加入一定量的纤维素酶，改变了其果皮细胞壁的通透性，促进了无患子果皮细胞中皂苷的溶出，使得提取率增加，且要达到一定的酶活浓度皂苷提取率才有显著提高，对于越粗的原料粉末所需酶活浓度越高。

2.3 酶解时间对无患子皂苷提取率的影响

1-2号筛、2-3号筛无患子粉末加酶量分别为18、12 U/mL，50℃条件下酶解0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h，考察酶解时间对无患子皂苷提取率的影响。由图5可知，1-2号筛无患子粉末（最粗粉）随着酶解时间的延长，皂苷提取率先增加后略有降低，当酶解时间为2.5 h时皂苷提取率为3.16%，达到最大值，之后便不再增加，因此对于1-2号筛无患子粉末在加酶量为18 U/mL时酶解2.5 h即可。2-3号筛无患子粉末（粗粉）随着酶解时间的延长，皂苷提取率先增加后下降，当酶解时间为1.5 h时皂苷提取率最大，达3.32%，之后随着酶解时间的延长皂苷提取率不再增加。因此对于2-3号筛无患子粉末在加酶量为12 U/mL时最佳酶解时间为1.5 h。

图5 酶解时间对1-2号筛、2-3号筛无患子皂苷提取率的影响

综上分析，2种粒度无患子粉末在最佳纤维素酶添加量的条件下，皂苷提取率均随着酶解时间的延长先增加，当达到一定时间时皂苷提取率均不再增加，可能是因为2种粒度的无患子粉末在各自酶添加量的条件下分别提取2.5、1.5 h后酶促反应已达到平衡，之后略有下降可能是因为无患子皂苷大部分为三萜皂苷，而三萜皂苷多具有羧基，纤维素分解产物葡萄糖可能会与其发生酯化反应使得皂苷提取率有所下降，并且无患子皂苷提取率随酶解时间的变化并不显著。

2.4 酶解温度对无患子皂苷提取率的影响

1-2号筛、2-3号筛无患子粉末在酶添加量分别为18、12 U/mL，提 取 温 度 分 别 为30、40、50、60、70℃，酶解1.5 h时，考察酶解温度对无患子皂苷提取率的影响。由图6可知，1-2号筛无患子粉末随着酶解温度的升高，皂苷提取率上升，50℃时提取率最大，达3.00%，继续升高温度则皂苷提取率显著下降，因此对1-2号筛无患子粉末最适提取温度为50℃。2-3号筛无患子粉末随着酶解温度的增高，皂苷提取率逐渐增大，至50℃时达到最大，提取率为3.28%，之后随温度升高皂苷提取率反而明显下降。

图6 酶解温度对1-2号筛、2-3号筛无患子皂苷提取率的影响

综上分析，酶解温度对2种粒度的无患子皂苷提取率均有显著影响，由于高温会破坏纤维素酶的蛋白结构使酶变性失活从而导致皂苷提取率显著下降，同时低温也会抑制纤维素酶的活性使得温度低于50℃时皂苷提取率偏低。

3 小结

本试验首次对无患子果皮粉末进行了粒度分级并按粒度优化了纤维素酶法提取无患子皂苷的工艺条件，探究多种纤维素酶对不同粒度的无患子粉末的影响，得出当粉末粒度大于5号筛时纤维素酶对无患子皂苷提取率几乎无影响或促进作用较小，即当植物细胞粉碎得很细时极大促进了皂苷的溶出从而使酶的破壁作用不明显，纤维素酶法提取无患子皂苷的较优工艺条件为1-2号筛粉末（最粗粉）酶添加量18 U/mL，酶解时间2.5 h，酶解温度50℃；2-3号筛粉末（粗粉）酶添加量12 U/mL，酶解时间1.5 h，酶解温度50℃，对于粒度大于5号筛的考虑成本因素可不加纤维素酶提取，该方法经济环保，可有效提高无患子中皂苷的提取率，为纤维素酶法工业化提取无患子皂苷打下基础。