Notch 信号通路在妊娠期DN 小鼠中的表达意义

石 琳，陈国庆，王艳荣，雷 晨，张 勇

（1.宁夏医科大学总医院儿科，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学总医院内分泌科，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学公共卫生学院，宁夏 银川 750004）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指在妊娠期发生或首次发现的不同程度的糖耐量异常，随着肥胖的流行和孕产妇年龄的增高，GDM 患病率不断上升[1]。GDM 可增加巨大儿、难产儿、早产儿、畸形胎儿及死胎的分娩率[2]。研究表明，GDM 时高糖状态可刺激肾组织细胞葡萄糖转运异常，导致孕妇肾组织糖原累积，从而增加对葡萄糖的利用，以致产生过多的中间代谢产物，最终通过激活多元醇通路、晚期糖基化终末代谢产物、二酰甘油-蛋白激酶C 途径等进一步损害肾脏组织[3]。而GDM肾脏损害的发病机制极其复杂，血脂异常、高血压、血管功能障碍及其他心脏代谢异常等因素均与GDM 肾脏损害有关[4]。近年来，不断有研究发现Notch 信号通路在肾小管上皮细胞损伤中发挥着重要作用[5-6]。但Notch 信号通路在GDM 肾脏损害中的作用机制尚不清楚。本研究通过建立GDM 小鼠模型，检测小鼠肾组织标本中Notch 信号通路家族成员（Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1）的表达情况，以观察Notch 信号通路是否参与妊娠期糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）肾脏损害过程，旨在深入分析妊娠期DN 肾脏损害的发病机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12 只清洁级别的C57BL/6 小鼠（6～8 周龄）由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，体重18～22g，实验动物合格证号：[SCXK（京）：2019-0007]。饲养条件：温度控制在22℃～26℃，相对湿度控制在50%～60%，光照条件控制为12h 光处理和12h 暗处理交替循环，适应性喂养2 周。本研究方案通过单位动物伦理学审查。

1.2 试剂与仪器

①试剂：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，北京索莱宝科技有限公司），水合氯醛（天津市光复精细化工研究所），蛋白酶抑制剂[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），一抗Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1（Thermo Fisher 公司），β-actin 抗体（英国Abcam 公司），辣根过氧化酶标记二抗（北京全式金生物技术有限公司），PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒（日本Takara 公司），LightCycler 480 SYBR Green I Master 试剂盒（Roche 公司），葡萄糖测定试剂盒（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），糖化血红蛋白分析试剂盒（挪威Axis-Shield 公司）。②仪器：石蜡切片机（德国SLEE 公司），全自动生化分析仪（美国Beckman 公司），实时荧光定量PCR 仪、蛋白印迹电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型的建立

所有小鼠使用普通实验动物饲料适应性喂养2周，按2:1 的比例将雌鼠与雄鼠合笼，于第2 日清晨检查小鼠阴道栓或阴道分泌物涂片镜检，发现精子者记为妊娠0 天，标记孕鼠开始计算孕期，所有雌鼠孕前血糖水平正常。将孕鼠分为DN 组和对照组，每组各6 只。DN 组孕鼠腹腔注射2% 的STZ 溶液（55mg/kg），以制备DN 模型，对照组孕鼠予以腹腔注射等量枸椽酸盐缓冲液（0.1mmol/L）。1 周后测定造模小鼠的血糖和尿糖水平，血糖≥16.67mmol/L、尿糖≥3+为造模成功的DN 小鼠，分别于成模后2、4、8 周，收集小鼠血液，检测生化指标；8 周末，使用10%水合氯醛腹腔注射处死小鼠，取其肾脏组织，使用4%中性甲醛固定用于HE 染色及免疫组织化学染色；取部分肾脏组织用于提取蛋白和RNA，Western blot 检测Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1 蛋白表达，Real-time PCR 检测Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 的表达。

1.3.2 生化指标检测

生化指标包括血糖（blood glucose，Glu）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及尿酸（uric acid，UA）水平。采用己糖激酶法检测Glu 水平，采用HbA1c 分析试剂盒检测HbA1c 水平，采用全自动生化分析仪检测Scr、BUN、UA 水平。

1.3.3 HE 染色

取两组小鼠肾组织标本，制作石蜡切片，进行苏木精伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，于光镜下观察肾脏组织的病理学形态，并拍照。

1.3.4 免疫组织化学染色

取两组肾脏组织标本，制作石蜡切片，常规脱蜡水化，进行抗原修复，加入3%H2O2清除内源性过氧化物酶，滴加山羊血清进行封闭，滴加一抗[Notch1（1∶300）]，滴加二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，进行DAB 显色，滴加苏木精复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照。阳性结果：可见棕黄色或棕褐色染色。

1.3.5 Western blot检测Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表达水平

取两组肾脏组织标本，加入1mL 蛋白裂解液进行组织匀浆，冰上裂解30min，4℃、12 000rpm 离心10min，弃掉上清液，测定蛋白浓度；取30μg 蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭，一抗[Notch1（1∶500）、Jagged1（1∶300）、Hes1（1∶300）、Hey1（1∶500）、β-actin（1∶5 000）]孵育过夜，二抗（1∶5 000）孵育2h；滴加预先配制的ECL 化学发光混合液，避光静置5min，置于显影仪中曝光显影并拍照，采用Gel 凝胶图象处理软件检测各样品蛋白灰度值，并计算目的蛋白表达水平，目的蛋白表达水平以目的蛋白灰度值和内参蛋白灰度值比值表示。

1.3.6 Real-time PCR 检测Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相对表达量

取两组肾脏组织标本，加入1mL Trizol 溶液进行裂解，按说明书操作提取总RNA；测定RNA 浓度，使用PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒进行逆转录，得到cDNA；以cDNA 为模板进行RT-PCR，Jagged1、Notch1、Hes1 和Hey1 作为目的基因，β-actin作为内参基因。β-actin 引物序列为：F：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，R：5′-CCA AGA AGA AGG CTG GAA AA-3′；Notch1 引物序列为：F：5′-GTG GAT GAC CTA GGC AAG TCG-3′，R：5′-GTC TCC TCC TTG TTG TTC TGC A-3′；Jagged1 引物序列为：F：5′-AGA AGT CAG AGT TCA GAG GCG TCC-3′，R：5′-AGT AGA AGG CTG TCA CCA AGC CAA C-3′；Hes1引物序列为：F：5′-CAC GAC ACC GGA CAA ACC A-3′，R：5′-GCC GGG AGC TAT CTT TCT TAA GTG-3′；Hey1 引物序列为：F：5′-AAG ACG GAG AGG CAT CAT CGA G-3′，R：5′-CAG ATC CCT GCT TCT CAA AGG CAC-3′。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，采用2-△△Ct法计算Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相对表达水平。

1.4 统计学方法

运用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间对比采用t检验，组内不同时间对比采用重复测量方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠肾脏组织形态观察结果

8 周时，HE 染色可见对照组小鼠肾小管结构清晰且正常，而DN 组小鼠肾小球体积增大，基底膜不规则增厚，肾小管上皮细胞出现空泡样变性，见图1。

图1 HE 染色观察小鼠肾组织形态（×400）Fig.1 Observation of kidney tissue morphology of mice by HE staining(×400)

2.2 两组小鼠生化指标比较

2 周、4 周、8 周时，DN 组小鼠Glu、HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平均显著高于对照组小鼠（P＜0.05），且HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平随着DN 病程延长而升高，见表1。

表1 两组小鼠生化指标比较（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators between the two groups (±s)

表1 两组小鼠生化指标比较（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators between the two groups (±s)

注：F1、P1 是DN 组2 周、4 周、8 周的比较；t1、P1 为对照组与DN 组2 周比较；t2、P2 为对照组与DN 组4 周比较；t3、P3 为对照组与DN 组8 周比较。

组别对照组DN 组2 周4 周8 周F1/P1 t1/P1 t2/P2 t3/P3 Glu（mmol/L）7.75±1.30 HbA1c（%）3.49±0.68 Scr（μmol/L）24.16±4.05 BUN（mmol/L）10.31±2.57 UA（μmol/L）102.05±16.39 128.27±19.03 145.49±21.15 185.72±24.68 11.030/0.001 2.557/0.029 3.977/0.003 6.981/＜0.001 26.83±3.74 27.50±3.09 29.84±4.16 1.101/0.358 11.804/＜0.001 14.431/＜0.001 12.415/＜0.001 6.72±0.81 10.06±1.47 15.37±2.03 49.370/＜0.001 7.481/＜0.001 9.936/＜0.001 13.593/＜0.001 30.35±4.98 37.81±6.33 51.83±7.92 16.778/＜0.001 2.362/0.040 4.449/0.001 7.619/＜0.001 19.10±2.84 24.94±4.16 36.18±6.04 21.931/＜0.001 5.621/＜0.001 7.329/＜0.001 9.654/＜0.001

2.3 免疫组织化学染色观察两组小鼠肾脏组织中Notch1 表达情况

免疫组织化学染色结果显示，Notch1 阳性定位于肾小球固有细胞及肾小管上皮细胞胞浆，呈黄色或棕黄色，对照组小鼠肾小球和肾小管上皮细胞中几乎不表达Notch1，DN 组小鼠肾小球中可见少量Notch1表达，肾小管上皮细胞Notch1大量表达，见图2。

图2 免疫组织化学染色观察两组小鼠肾组织中Notch1 表达情况（×400）Fig.2 Observation of Notch1 expression in kidney tissue of mice in the two groups by immunohistochemical staining(×400)

2.4 两组小鼠Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表达水平比较

DN 组小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表达水平均显著高于对照组小鼠（P＜0.05），见表2。

表2 两组小鼠Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of protein expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

表2 两组小鼠Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表达水平比较（±s）Table 2 Comparison of protein expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

组别对照组DN 组tP Notch1 0.14±0.03 0.23±0.05 3.781 0.004 Jagged1 0.42±0.06 0.85±0.09 9.738＜0.001 Hes1 0.38±0.05 0.77±0.06 12.231＜0.001 Hey1 0.17±0.04 0.39±0.07 6.684＜0.001

2.5 两组小鼠Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1mRNA 相对表达量比较

DN 组小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相对表达量均显著高于对照组小鼠（P＜0.05），见表3。

表3 两组小鼠Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 3 Comparison of mRNA relative expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

表3 两组小鼠Notch 信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 3 Comparison of mRNA relative expression levels of Notch1, Jagged1, Hes1 and Hey1 in Notch signaling pathway between the two groups of mice(±s)

组别对照组DN 组tP Notch1 1.02±0.07 1.55±0.19 6.411＜0.001 Jagged1 0.98±0.08 1.64±0.15 9.510＜0.001 Hes1 0.95±0.07 2.41±0.22 15.490＜0.001 Hey1 1.03±0.05 1.68±0.16 9.498＜0.001

3 讨论

3.1 Notch 信号通路在肾小球疾病中的作用

在许多慢性肾脏疾病中，Notch 信号通路成员被认为是肾损害的生物标志物[7]。Notch 信号通路可在肾再生、足细胞凋亡、增殖、成纤维细胞活化及诱导肾小管上皮细胞向间充质转化等过程中发挥重要作用[8]。Yao 等[9]通过使用血管紧张素Ⅱ刺激小鼠足细胞，结果发现，小鼠足细胞中Notch1、Hes1、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白表达明显上调，而干扰Notch 可抑制Ⅳ型胶原和层粘连蛋白表达，提示Notch 信号通路在血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞外基质合成中起着重要作用。Nishad 等[10]报道指出，激活Notch 信号通路可调控上皮间充质转换和肾纤维化，抑制Notch 信号通路可能成为DN 的潜在治疗靶点。故Notch 信号通路可能是糖尿病肾脏损害的原因之一。

3.2 Notch 信号通路与DN 肾脏损害的关系

方晓琳等[11]研究表明，通过抑制Notch 信号通路可降低高糖诱导的人肾小管上皮HK-2 细胞内活性氧的产生，从而抑制肾小管上皮细胞凋亡。另外，有研究亦显示，调节活性氧产生和诱导细胞凋亡的重要蛋白适配器P66shc 在STZ 诱导的DN 小鼠中表达明显上调，培养的MPC5 足细胞经高糖处理后其存活率明显降低，P66shc 过表达进一步加速细胞凋亡，而抑制Notch 信号通路可下调P66shc 表达，提示高糖环境下P66shc 通过Notch 信号通路诱导足细胞凋亡[12]。本研究结果显示，2 周、4 周、8 周时，DN 组小鼠Glu、HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平均显著高于对照组小鼠，且HbA1c、Scr、BUN 及UA 水平随着DN病程延长而升高，表明DN 小鼠存在明显的肾损伤，且随着病程延长，小鼠肾损伤越严重。本研究中，免疫组织化学染色结果显示，对照组小鼠肾小球和肾小管上皮细胞中几乎不表达Notch1，DN 组小鼠肾小管上皮细胞Notch1 大量表达，肾小球中也可见少量Notch1 表达，提示Notch1 上调表达参与了DN 小鼠肾损伤过程。

本研究通过进一步分析发现，DN 组小鼠Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 蛋白表达水平均显著高于对照组小鼠，Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 mRNA 相对表达量也显著高于对照组小鼠，提示Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 均参与了DN 小鼠肾损害过程。刘兴梅等[13]报道表明，DN 小鼠肾脏组织中Notch1 蛋白表达明显增加，自噬和纤维化被明显抑制，其机制可能与激活蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白信号通路有关。此外，Chen 等[14]研究指出，通过阻断Notch 信号通路能够抑制肾小球硬化和肾小管间质损伤，从而减轻尿毒症症状。Tian 等[15]亦发现，抑制Notch 信号通路可改善DN 小鼠抗氧化反应，延缓肾间质纤维化，改善糖尿病症状。故通过阻断Notch 信号通路可能会减轻DN 的肾损害程度，改善DN 肾脏预后，进而为DN 临床治疗提供科学根据。但Notch 信号通路在DN 小鼠肾损害中的具体作用机制有待深入研究。

综上所述，DN 小鼠肾脏组织中Notch 信号通路蛋白表达明显增加，Notch 信号通路可能在DN 肾脏损害发生和发展中发挥着重要作用，深入研究Notch信号通路在DN 肾脏损害中的具体作用机制，有助于指导临床寻找有关DN 治疗的新的分子靶点，具有一定意义。