早产和足月新生儿串联质谱筛查切值的建立

王 琼，齐志业，姚 勤，段 江，钟庆华，张彩营，梁 琨

（昆明医科大学第一附属医院新生儿遗传代谢病筛查中心，云南 昆明 650032）

相较于传统的一种方法只能检出一种疾病的生化检测方法，串联质谱技术运用一个滤纸干血斑标本，1 次实验可检测40 多种指标，筛查数十种氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢病，兼具高效性、特异性和敏感性，越来越多的遗传代谢病通过串联质谱检测被诊断。然而正确评估是否患病的主要标准是将检测结果与切值（cut-off value）进行比较，因此制定适合自己实验室的筛查切值尤为重要。国内外研究显示，不同出生胎龄、体重的新生儿氨基酸、肉碱代谢水平存在差异[1-4]，本研究回顾性分析了昆明医科大学第一附属医院新生儿遗传代谢病筛查中心不同出生胎龄新生儿的干血斑中氨基酸、游离肉碱和酰基肉碱浓度水平，并分别建立其参考区间。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2013 年1 月至2020 年12 月在昆明医科大学第一附属医院新生儿遗传代谢病筛查中心做串联质谱筛查的52 526 例新生儿干血斑标本，根据出生时胎龄（gestational age，GA）不同，分为早产组（32 周≤胎龄＜37 周）和正常孕周组（37 周≤胎龄≤42 周），分别有5 694 例、46 832 例。本研究获得家属知情同意，并签署知情同意书。

1.2 样本采集

按照新生儿疾病筛查技术规范（2010 版）的要求，于生后3～7d 内、充分哺乳6 次后采集新生儿足跟血，滴于whatman 903 号滤纸片，形成直径≥8mm 的3 个血斑。血片采集后悬空平置，室温自然干燥成深褐色，塑料袋密封装好，在5 个工作日内送至新生儿遗传代谢病筛查中心实验室，放入4℃冰箱保存备检。

1.3 试剂、仪器和检测方法

采用美国PerkinElmer 公司的非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒（neobase non-derivatized MSMS Kit），对滤纸干血斑中的11 种氨基酸、游离肉碱（C0）和31 种酰基肉碱进行检测，仪器为美国ABI（Applied Biosystems）公司的API3200MDTM 串联质谱系统，检测方法按照试剂盒操作说明书进行。

1.4 质量控制

每批次实验均采用PerkinElmer 公司的非衍生化多种氨基酸、肉碱测定试剂盒内的高低两种水平质控品进行检测，结果均符合质控要求。室间质控为每年参加国家卫生健康委员会临床检验中心的新生儿串联质谱筛查-氨基酸和酰基肉碱的室间质量评价，同时参加美国CDC（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的室间质量评价体系，成绩均合格。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。偏态分布资料以四分位数表示。组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。选用第0.5 百分位值与第99.5 百分位值作为切值的上下限[5]。

2 结果

2.1 两组一般情况比较

早产组与正常孕周组的性别、采血日龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组新生儿一般情况比较[n（%）,xˉ±s]Table 1 Comparison of general situation of neonates between the two groups[n(%),xˉ±s]

2.2 不同出生胎龄新生儿氨基酸、游离肉碱和酰基肉碱参考区间的建立

采用第0.5 百分位值与第99.5 百分位值（P0.5～P99.5）作为不同出生胎龄新生儿11 种氨基酸、游离肉碱和30 种酰基肉碱参考区间的上下限，见表2。结果显示，11 种氨基酸及C0、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C10、C14、C14:2、C16:1、C18:2 的99.5% 上限值：早产组高于正常孕周组；C6DC、C12、C16 的99.5%上限值：早产组低于正常孕周组；C0 的0.5%下限值：早产组高于正常孕周组；瓜氨酸、甲硫氨酸、C16、C18、C18:1 的0.5%下限值：早产组低于正常孕周组。其余酰基肉碱的0.5%下限值与99.5%上限值在两组间无明显变化或相差不大。

表2 不同出生胎龄新生儿氨基酸、游离肉碱和酰基肉碱参考区间（μmol/L，P0.5～P99.5）Table 2 Reference ranges of amino acids, free carnitine and acyl carnitine for neonates with different gestational ages（μmol/L,P0.5～P99.5）

2.3 参考区间重设定前后部分质量指标变化情况

对于之前筛查的阳性结果及部分筛查质量指标，用重新设定的参考区间做前后分析，重设定参考区间后，假阳性率在早产组和正常孕周组分别由8.17%、4.86% 下降到3.72%、1.48%，阳性预测值分别由0.56%、1.44%上升到2.17%、3.41%，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 参考区间设定前后部分质量指标对比分析Table 3 Comparison of some quality indexes before and after reference range setting

3 讨论

3.1 新生儿遗传代谢病串联质谱筛查切值设置的重要性

遗传代谢病（inherited metabolic diseases，IEM）是由于基因突变引起酶、受体、载体等蛋白活性降低或功能缺陷，导致体内生化物质在合成、代谢、转运和储存等方面出现各种异常，造成中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏，从而导致机体生化代谢紊乱，引起一系列临床症状的一组特殊疾病[6]。串联质谱检测技术的运用，使我们能检测更多的遗传代谢病，而不恰当、不合理的切值设定可能导致假阴性或者假阳性，造成临床判读的偏差[7-8]。国家卫生健康委临床检验中心2017 年室间质量评价（external quality assessment，EQA）计划临床判断值的调查结果显示，35%的实验室氨基酸和酰基肉碱临床判断值与预期结果不一致。分析原因发现，其中68%的实验室是由于切值设置不合理造成的[9]。

3.2 早产组和正常孕周组串联质谱筛查切值分析

早产儿与足月儿体内相关代谢酶成熟度存在差异，血液代谢物水平也有较大差异，检测结果可能过高或过低，故切值计算需要考虑胎龄因素，提高筛查特异度，尽量避免假阳性或假阴性[10-11]。本研究也发现，11 种氨基酸及C0、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C10、C14、C14:2、C16:1、C18:2 的99.5%上限值，早产组高于正常孕周组。C6DC、C12、C16 的99.5%上限值，早产组低于正常孕周组。因为C0 降低提示原发性肉碱缺乏症，而C0 的0.5%下限值早产组高于正常孕周组，C16、C18 和C18:1 降低提示肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ缺乏症，C16、C18、C18:1 的0.5%下限值早产组低于正常孕周组。瓜氨酸降低提示尿素循环障碍相关疾病，甲硫氨酸降低提示甲基丙二酸血症或同型半胱氨酸血症，瓜氨酸和甲硫氨酸的0.5%下限值早产组也低于正常孕周组，所以临床判断时要考虑胎龄因素，避免假阳性和假阴性。其余酰基肉碱的0.5%下限值与99.5%上限值在两组间无明显变化或相差不大。

通过对部分筛查质量指标进行参考区间设定前后的对比分析，发现不管是早产组还是正常孕周组，筛查的假阳性率均明显下降，阳性预测值均提高，且差异有统计学意义，说明按照不同胎龄对串联质谱检测参考区间进行设定，分别进行阳性预判，能大大提高检测的特异度，降低假阳性率。

3.3 展望

本研究的早产组数据，仅包括32 周≤胎龄＜37周，后续应该对胎龄＜32 周，以及不同出生体重的新生儿串联质谱筛查数据进行分析，进一步完善阳性切值。随着实验数据的不断增多，也需要定期调整参考区间。也建议各实验室根据自己区域人群、地区差异、实验方法的不同而建立适合自己实验室的串联质谱检测参考区间，利用大数据建立早产儿独立的新生儿筛查的切值[12]，降低假阳性率或假阴性率，提高阳性预测值。