黄连对2型糖尿病大鼠调节性T细胞及相关炎症因子的影响

郭志利，左晓琦，张 梅，康秉南，姚玉英

(1. 石家庄医学高等专科学校，河北 石家庄 050599；2. 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000;3. 石家庄科技信息职业学院，河北 石家庄 050091)

糖尿病作为一种常见的内分泌系统慢性病，需要患者长期服药并定期门诊随访调节药物剂量，由于患者依从性差或其他原因导致血糖控制不佳，往往容易诱发糖尿病并发症。2型糖尿病作用的靶器官包括心、脑、视网膜、肾脏等，同时该病可以增加感染风险，导致患者后期致残或器官衰竭。目前2型糖尿病治疗包括饮食运动控制、二甲双胍口服、胰岛素注射等[1]，中医药的应用也逐渐普及。该病发病机制复杂，其中一种机制是患者体内调节性T细胞分泌异常导致炎症因子大量产生而作用于正常胰岛细胞，从而导致胰岛素抵抗[2-3]。黄连是解毒清热中药，其提取物小檗碱具有降低患者体内炎症反应作用[4]。本实验观察了黄连对高脂加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠调节性T细胞及相关炎症因子的影响，旨在进一步明确其作用机制，为其临床应用提供客观依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级雌性SD大鼠110只，鼠龄5周左右，体重(440±6.8)g，由河北医科大学第四医院提供，动物许可证号：SYXK(冀)2018-001。所有大鼠于层流架内分笼饲养，专人负责管理。实验室定期消毒，环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。饲养1周后开始实验。

1.2主要试剂 柠檬酸及柠檬酸钠购于山东省中创柠檬生化有限公司；链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司。小檗碱注射液(规格：10 mL/支)购于山东优维药业有限公司；血清胰岛素ELISA试剂盒购于欣博盛生物有限公司；TRIzol 购于Thermo Fisher公司；即用型PBS粉剂购于武汉谷歌生物科技有限公司；荧光定量RNA逆转录试剂盒购于武汉基因美生物科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)qPCR引物购于上海杏园瑞民生物工程有限公司。

1.3主要仪器 MH550冰冻切片机购于美国Thermo Fisher公司；RT-2100C自动酶标仪购于美国雷杜公司；CytoFLEX流式细胞仪购于贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司；组织捣碎匀浆机购于天津博天胜达科技发展有限公司；台式离心机购于香港力新发展有限公司；快速实时荧光定量PCR仪购于广州华峰生物科技有限公司。

1.4实验方法 将所有大鼠进行编号，先正常饲养1周让大鼠适应实验室环境。采用随机数法选取25只大鼠作为正常组，给予常规大鼠饲料喂养；其余大鼠均给予自制高脂高糖饲料(基础饲料57.5%+蔗糖20%+猪油18%+胆酸钠0.5%+胆固醇4%)喂养。4周后，所有大鼠均禁食但不禁水12 h，随后高脂高糖喂养大鼠腹腔内注射STZ 60 mg/kg(临用前溶解在pH 4.2的0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液内)，正常组大鼠腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射72 h和1周后，大鼠尾静脉取血，测定空腹血糖(FPG)，2次FPG均≥16.7 mmol/L则表示造模成功。筛选造模成功大鼠75只，随机分为模型组、小檗碱低剂量组、小檗碱高剂量组，每组25只。小檗碱低、高剂量组分别给予0.125 mg/g和0.375 mg/g的小檗碱注射液(溶于5 mL生理盐水中)灌胃，正常组和模型组相同时间给予等体积的生理盐水灌胃，均1次/d，干预期间常规饲养，自由饮食。

1.5检测指标及方法

1.5.1FPG和空腹胰岛素(FINS)水平 分别于灌胃2，4，6，8，12周后，每组随机取5只大鼠，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，腹主动脉取血3 mL，室温静置2 h，4 ℃下3 000 r/min离心(离心半径13.5 cm)5 min，分离血清，采用葡萄糖氧化酶法检测FPG水平，采用ELISA法检测FINS水平。

1.5.2脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比 取血完毕后，沿着大鼠腹正中线切开，找到脾脏，分离取出。脾脏用生理盐水清洗后置于4%多聚甲醛内固定6 h，后依次放在装有20%和30%乙醇的瓶内脱水。脱水后用石蜡常规包埋，并使用聚乙二醇浸润，将其置于恒冷箱中，然后进行冠状面切片，厚度5 μm。每组大鼠随机取25片切片，碾碎成粉末状，随后加入EDTA抗凝。并在4 ℃环境下，以3 000 r/min离心(离心半径13.5 cm)5 min取上清液，置于流式细胞仪中检测CD4+CD25+调节性T细胞占比。

1.5.3脾脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-1β mRNA表达量 利用Real-time PCR 方法检测：从恒冷箱中取出灌胃2，4，6，8，12周后各组大鼠脾脏组织切片，每组25片，碾碎成粉末状，随后加入1 mL TRIzol溶液混匀。并在低温环境下，以8 000 r/min离心(离心半径13.5 cm)6 min取上清液，加入新的离心管中，然后使用氯仿、异丙醇处理2次，再次8 000 r/min(离心半径13.5 cm)离心6 min，使用乙醇洗涤多余液体，获得RNA样品。此样品中加入DNA清洗液，去除多余DNA，然后使用反应体系反转录获得cDNA样品。将样品分别与TNF-α、IFN-γ和IL-1β引物进行作用，PCR反应条件设置为95 ℃下30 s使其变性，60 ℃退火，再90 ℃下使其延伸，通过Poly core软件，对其循环数进行计算，获得TNF-α、INF-γ和IL-1β mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠血清FPG、FINS水平比较 与同时间段正常组比较，模型组大鼠灌胃2，4，6，8，12周后血清FPG水平均显著升高，FINS水平均显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与同时间段模型组比较，小檗碱低、高剂量组大鼠灌胃2，4，6，8，12周后血清FPG水平均显著降低,PINS水平均显著升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)；与同时间段小檗碱低剂量组比较，小檗碱高剂量组6，8，12周后血清FPG水平均更低，FINS水平均更高，差异均有统计学意义(P均<0.05)，2组大鼠灌胃2，4周后血清FPG、FINS水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及表2。

表1 正常组和2型糖尿病各组大鼠血清FPG水平比较

2.2各组大鼠脾脏组织中调节性T细胞占比比较模型组大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比均显著低于同时间段正常组(P均<0.05)；小檗碱低、高剂量组大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比均显著高于同时间段模型组(P均<0.05)；小檗碱高剂量组大鼠灌胃6，8，12周后脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比均显著高于同时间段小檗碱低剂量组(P均<0.05)，2组大鼠灌胃2，4周后脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表2 正常组和2型糖尿病各组大鼠血清FINS水平比较

表3 正常组和2型糖尿病各组大鼠脾脏组织中CD4+ CD25+调节性T细胞占比比较

2.3各组大鼠脾脏组织中炎症因子mRNA表达量比较 模型组大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾脏组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相对表达量均显著高于同时间段正常组(P均<0.05)；小檗碱低、高剂量组大鼠灌胃2，4，6，8，12周后脾脏组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相对表达量均显著低于同时间段模型组(P均<0.05)；小檗碱高剂量组大鼠灌胃6，8，12周后脾脏组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相对表达量均显著低于同时间段小檗碱低剂量组(P均<0.05)，2组大鼠灌胃2，4周后脾脏组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4～6。

3 讨 论

表4 正常组和2型糖尿病各组大鼠脾脏组织中TNF-α mRNA相对表达量比较

表5 正常组和2型糖尿病各组大鼠脾脏组织中IFN-γ mRNA相对表达量比较

表6 正常组和2型糖尿病各组大鼠脾脏组织中IL-1β mRNA相对表达量比较

中医认为2型糖尿病及其并发症归于“消渴”“消癉”等范畴，患者多以阴津亏损、阴虚为本，燥热偏盛为标，标本相辅相成，并有血瘀贯穿[5]。中医治宜清热润燥、养阴生津、活血化瘀等。黄连性寒，味苦，归脾经、大肠经，属于清热燥湿药，其主要有效成分为小檗碱，小檗碱进入机体后激活G蛋白耦联受体，进入胞质内激活腺苷酸环化酶(AC)，从而使G蛋白-AC通路介导蛋白激酶A( PKA)活化，PKA可以调节细胞内糖脂代谢[6]。故本实验选用小檗碱注射液作为实验用药。

2型糖尿病是临床上最常见的一种糖尿病类型，占糖尿病患者总数的90%左右[7]。2型糖尿病的发病因素有很多，但肥胖是关键元凶，尤其是中心性肥胖。过量的高脂饮食导致脂肪异位堆积阻碍正常细胞的氧化代谢，降低胰岛素的敏感性，启动胰岛素抵抗，加重机体糖脂代谢紊乱[8-9]。目前研究认为，高脂高糖联合STZ共同诱导建立的2型糖尿病大鼠模型与人类2型糖尿病发病模式最符合[10]，所以本实验采用该方法建模。

目前研究证实，2型糖尿病患者体内呈慢性炎症状态，机体非特异性免疫应答异常[11]。CD4+CD25+调节性 T细胞是非特异性免疫应答的核心细胞，其表达异常会使M2型巨噬细胞数量增多，引起CD8+T细胞增加，作用于脂肪组织中的脂肪细胞分泌炎症因子，损伤胰岛细胞，导致胰岛素分泌异常，血糖升高；上调CD4+CD25+调节性 T细胞表达，其可通过抑制Th1型细胞因子分泌及分泌IL-10等细胞因子,抑制炎症反应，改善胰岛分泌功能[12-14]。既往研究证实，2型糖尿病大鼠血清中炎性因子TNF-α、INF-γ、IL-1β水平会升高[15]，但是这些因子在血清中的表达量易被血清中其他物质干扰导致测量不准，所以本实验测定了大鼠脾脏组织中TNF-α、INF-γ、IL-1β的mRNA表达量。

本实验结果显示，随着小檗碱灌胃时间延长，小檗碱低、高剂量组FPG水平及脾脏组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表达量均呈下降趋势，FINS水平及脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比均呈上升趋势，同时灌胃6周、8周、12周后小檗碱高剂量组FPG水平及脾脏组织中TNF-α、IL-1β、IFN-γ mRNA表达量均显著低于同时间段小檗碱低剂量组，FINS水平及脾脏组织中CD4+CD25+调节性T细胞占比均显著高于同时间段小檗碱低剂量组。说明小檗碱可以明显降低高脂加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠血糖水平，升高血清胰岛素水平，机制可能与上调CD4+CD25+调节性 T细胞表达，下调炎症因子TNF-α、INF-γ和IL-1β表达有关，且这种作用与小檗碱剂量及应用时间有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。