杞黄葛复方对组织工程肝脏非酒精性脂肪性肝病模型的肝脏保护作用研究

黄 龙,刘 霜,陈 煜，段钟平

(首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心/肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室，北京 100069)

脂肪肝根据病因可分为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、酒精性脂肪性肝病(简称酒精性肝病)、特殊类型脂肪肝3类，其中NAFLD最为常见[1]。NAFLD是指除外酒精和其他损肝因素，人体发生的以肝细胞内脂肪过多沉积为主要特征的一类疾病，多是由于运动偏少、营养过剩、摄入脂肪过多所致[2]。随着肥胖、高血脂、高血糖及其相关代谢综合征全球化的流行，NAFLD现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区、富裕人口慢性肝病的重要病因，如果不及时干预，甚至会发展为肝纤维化和肝癌[3-4]。杞黄葛复方是由多名专家按照张仲景中医理论并结合多年经验，反复论证形成的纯中药经验处方，其配料为枸杞子、黄精、葛根、决明子、山楂等。方中枸杞子滋肾润肺、补肝明目，黄精补气养阴、健脾润肺、益肾，全方具有保肝明目、补气养阴等作用，临床用于治疗NAFLD显示出较好疗效，但其作用机制不明确。由于NAFLD是多因素作用的结果，采用传统方法研究其发病机制及药物作用机制相当困难，因此需要新的体外疾病模型进行全面评估[5]。首都医科大学肝病研究所及首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心团队，经过多年努力，创新性地构建了3D组织工程肝NAFLD模型，该模型采用人的肝细胞，种属差异性小，可以更好地模拟脂肪肝损伤的病理特征，是一种良好的NAFLD体外模型。因此本研究通过体外建立3D组织工程肝NAFLD模型，探讨了杞黄葛复方对NAFLD的保护作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物及细胞 雄性Sprague-Dawley大鼠12只，体重180～220 g，购于斯贝福实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。实验前正常饲养。人HepG2细胞来自于首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心四科实验室。

1.2药物、试剂与仪器 杞黄葛复方由河南医圣堂药业有限公司提供；实验用DMEM购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；胎牛血清、胰酶、青链霉素购自美国Gibco公司；PCR提取试剂盒为TaKaRa RNA PCR Kit(AWV)；蠕动泵购自Master-Flex；0.22 μm滤器(millex-GV)、SDC购自VETEC；一次性静脉留置针(泰尔茂Hybria II B型三通)、CCK8试剂盒购自DOJINDO公司；活性氧(ROS)检测试剂盒购自上海碧云天公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和三酰甘油(TG)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3实验方法 本研究方案经北京佑安医院实验动物伦理委员会审批(AEEI-2020-076),符合实验室动物管理与使用准则。

1.3.1基于去细胞支架的组织工程肝脏的构建大鼠禁食24 h、禁水4 h，用10%水合氯醛麻醉后打开腹腔，暴露肝脏及门静脉，从门静脉插入静脉留置针，固定后开启蠕动泵，流速15～20 mL/min，冲洗约20 min。随后序贯性泵入2% PLA2酶10 min、预冷的生理盐水20 min，然后尽量完整摘取整个肝脏，对肝脏支架结扎、修剪并保留肝中叶，放置于事先装好DMEM的无菌异形瓶内，连接蠕动泵装置，在37 ℃、5% CO2的培养箱中循环灌流过夜。

1.3.2高脂培养基的配制 将1 mol/L油酸和棕榈酸按2∶ 1比例混合37 ℃预热后与110 μL NAOH和8.8 mL DMEM混合吹匀超声振荡10～30 min，直到无颗粒存在。接着将34.2 mL的2%BSA加入进去充分混匀，同时用盐酸进行调定pH值至7.4。将以上混合液进行过滤后，取20 mL加入到500 mL DMEM(内含5mL牛胎血清和5mL三抗)中，置于4 ℃冰箱留存备用。

1.3.3细胞培养及模型再细胞化 将人HepG2细胞于DMEM培养基(加入10%牛胎血清和5%双抗)中培养。基于成年大鼠安静期间肝脏血流速度[85 mL/(min·kg)],每个肝脏支架以9 mL/min的灌注速率分3次接种人HepG2细胞，每次1×107个细胞，共3 000万个。再细胞化完成后,实验分为3组，正常组用完全培养基培养；模型组每天灌注高脂培养基；杞黄葛复方组每天灌注高脂培养基，于第6天同时灌注100 μg/mL的杞黄葛复方培养3 d。3组均于第8天培养结束收集细胞用于后续实验。

1.3.4细胞毒性检测 实验分为空白组和7个药物组：将HepG2细胞配制成40～60个/μL 的细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μL。培养24 h后，向培养板中加入配置好的高脂培养基，作用48 h后，杞黄葛复方各浓度组分别加入1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1 mg/mL的杞黄葛复方溶液，空白组不加药。各组培养24 h后根据试剂说明书要求，每孔加入10 μL CCK8溶液，将培养板放在培养箱孵养20 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD值)，并计算细胞存活率。

1.3.5TG测定 取正常组、模型组、杞黄葛复方组肝脏模型消化下来的HepG2细胞，用PBS冲洗干净，并按照试剂盒说明书进行处理。然后将2.5 μL细胞匀浆加入96孔板中，与250μL 工作液混合，37 ℃孵育10 min。在510 nm处测量OD值，计算TG含量。

1.3.6ROS检测 取正常组、模型组、杞黄葛复方组肝脏模型消化下来的HepG2细胞，用PBS清洗干净，放入15 mL离心管中，1 500 r/min离心10 min，离心2次后弃掉上清，收集沉淀细胞，加入裂解液充分裂解细胞，取破碎后的细胞悬液，添加500 μL PBS和0.5 μL荧光探针DCFH-DA，在37 ℃水浴锅中加热40 min，并用PBS洗涤2次，添加200 μL PBS，混合样品，用荧光酶标仪480 nm激发波长，525 nm发射波长测定结果。根据ROS说明书公式计算细胞中的ROS含量。

1.3.7MDA检测 细胞悬液的获取同1.3.6，根据MDA试剂盒说明书在96孔板中加试剂和样本，充分混匀后，在37 ℃细胞孵育箱中培养20 min，在波长532 nm的多功能酶标仪中测定吸光度值，根据说明书公式计算细胞中MDA含量。

1.3.8SOD检测 细胞悬液的获取同1.3.6，根据SOD试剂盒说明书添加试剂和样本，使用多功能酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度值，根据说明书公式计算细胞中SOD含量。

1.3.9肝脏脂质合成途径相关酶和转录因子mRNA表达检测 采用RT-qPCR检测：用TRIzol提取总RNA，稀释后过紫外分光光度计，计算RNA浓度，然后用DNase处理，使用TakaRa试剂盒反转录后在ABI SteOnePlus机器上运行qPCR。数据收集使用ABI7500软件，结果显示以2-ΔΔCT形式体现，并用GAPDH标准化。引物序列：脂肪酸转位酶(CD36)上游引物5’-CTTTGGCTTAATGAGACTGGGAC-3’，下游引物5’-GCAACAAACATCACCACACCA-3’；载脂蛋白B(ApoB)上游引物5’-TGCCTGAGCAGACCATTGAG-3’，下游引物5’-TGTACGGTTGAGCTGCATGT-3’；脂肪酸合酶(FAS)上游引物5’-ACAGCGGGGAATGGGTACT-3’，下游引物5’-GACTGGTACAACGAGCGGAT-3’；ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)上游引物5’-TCGGCCAAGGCAATTTCAGAG-3’，下游引物5’-CGAGCATACTTGAACCGATTCT-3’；脂肪酸去饱和酶2(FADS2)上游引物5’-TGACCGCAAGGTTTACAACAT-3’，下游引物5’-AGGCATCCGTTGCATCTTCTC-3’；乙酰辅酶A羧化酶(ACC)上游引物5’-ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA-3’，下游引物5’-CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT-3’；脂肪酸结合蛋白1(FABP1)上游引物5’-GTGTCGGAAATCGTGCAGAAT-3’，下游引物5’-GACTTTCTCCCCTGTCATTGTC-3’；过氧化物酶增殖物激活受体γ (PPARγ)上游引物5’-GGAGGTCCGCATCTTTCACT-3’，下游引物5’-GCTACCAGCATCCCGTCTTT-3’。

1.4统计学方法 应用Graphpad Prism 8.0统计软件进行数据统计分析，计量资料均呈正态分布，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1杞黄葛复方的细胞毒性 1 ng/mL～1 mg/mL的杞黄葛复方各浓度组高脂培养的人HepG2细胞存活率与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，说明均无明显的细胞毒性，安全性良好。见图1。

图1 空白组和杞黄葛复方各浓度组人HepG2细胞存活率

2.2各组HepG2细胞中TG含量比较 模型组HepG2细胞中TG含量明显高于正常组(P<0.05)，杞黄葛复方组明显低于模型组(P<0.05)。见图2。

图2 正常组和组织工程非酒精性脂肪肝模型HepG2细胞中三酰甘油含量

2.3各组HepG2细胞中氧化应激相关指标比较模型组HepG2细胞中ROS、MDA含量均明显高于正常组(P均<0.05)，SOD含量明显低于正常组(P<0.05)；杞黄葛复方组HepG2细胞中ROS、MDA含量均明显低于模型组(P均<0.05)，SOD含量明显高于模型组(P<0.05)。见图3。

2.4各组HepG2细胞中肝脏脂质合成途径相关酶和转录因子mRNA表达情况 杞黄葛复方组HepG2细胞中CD36、FAS、ACLY、FADS2、ACC、FABP1、PPARγmRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，ApoB mRNA相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

3 讨 论

组织工程肝技术是近年来生物工程领域研究的热点，它是借助工程学原理，将肝细胞培养在特殊支架材料表面，形成具有肝脏功能的组织和类器官。

图3 正常组和组织工程非酒精性脂肪肝模型HepG2细胞中氧化应激相关指标含量

新一代的组织工程肝因为非常直观、功能接近人类自身肝脏的功能，所以目前除了用于肝衰竭等严重肝病治疗外，近年也将其作为药物筛选及评价平台和工具。首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心前期已经成功建立了大鼠去细胞的肝脏支架系统，借助该系统制备的新型组织工程肝，用于肝脏疾病模型、药理学、药物研发和暴露于体外的化合物的机制及毒理学研究，不但可以更加直观、科学地评价药物(单体或复方、中药或西药)作用，还能够显著降低药物试验过程中对人体潜在的危害。故本实验以此模型为平台探讨了杞黄葛复方对NAFLD的保护作用及可能机制。

图4 组织工程非酒精性脂肪肝模型HepG2细胞中肝脏脂质合成途径相关酶和转录因子mRNA表达情况

单纯脂肪肝是NAFLD的最早期阶段，其主要病理变化是肝细胞内以TG为主的脂滴大量堆积，当含有脂肪滴的肝细胞超过5%时，则认为存在肝细胞脂肪变[6-7]。 游离脂肪酸通常以TG的形式存储，TG的合成有2条途径：一是血液中的脂肪酸由肝细胞膜上的CD36 摄取进入肝细胞胞质后被FATP或脂酰辅酶A合成酶( ACS) 激活形成酰基辅酶A[8]；二是脂质的从头合成，即以柠檬酸盐为原料合成酰基辅酶A，其中ACC和FAS均为从头合成途径的限速酶。以上途径产生的酰基辅酶A再被甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)酯化形成溶血磷脂酸(LPA)和1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶(AGPAT)以形成磷脂酸 。磷脂酸通过脂质去磷酸化以形成二酰基甘油(DAG)，再通过酯化形成TG[9-10]。在病理状态下，肝细胞脂质从头合成产生的TG占总合成TG的1/3[11]。在这一过程中，这些酶起到了重要的作用。有研究表明，脂肪肝时CD36、FAS、ACLY、FADS2、ACC、FABP1会显著上调，从而促进TG的合成，合成的TG与ApoB在内质网中包装成极低密度脂蛋白(VLDL)，并分泌到窦周间隙中[12]。PPARγ是重要的与脂质合成相关的转录因子，其可以通过活化脂肪细胞中辅酶A，促进脂肪细胞中游离脂肪酸合成增加，继而导致TG合成增加，使脂肪细胞体积增大[13]。有研究发现，NAFLD的发生与 PPARγ基因的变异有明确的关联[14]。本研究中发现,杞黄葛复方干预后，TG的合成明显减少，与TG合成相关酶类和PPARγ的mRNA表达量明显降低，但ApoB mRNA表达量并没有什么变化，猜测可能与杞黄葛复方抑制了TG合成相关酶和转录因子的表达，从而减少了肝脏TG的合成，导致并没有太多的TG与载脂蛋白结合排泄出去有关。

在NAFLD期间，肝细胞不再耐受累积的脂肪酸的毒性，从而导致细胞稳态的功能障碍，包括线粒体β氧化和内质网应激的发生，随后导致肝细胞损伤和细胞死亡[15]。这一过程中会产生大量的ROS，破坏线粒体、内质网和NADPH氧化酶，最终影响细胞功能甚至引起肝细胞死亡，故氧化应激损伤可明显促进NAFLD的发展[16]。SOD 是一类能够催化超氧阴离子等自由基发生歧化反应且广泛存在于动植物体内的金属酶[17]，是机体内重要的抗氧化剂，可消除过剩的氧自由基及其衍生物，保护细胞免受损伤[18]。国外研究发现，氧自由基等多种因素可以引起氧化应激反应，导致肝脂肪变性[19]。万顺梅等[20]研究报道，NAFLD患者血清MDA含量明显升高，SOD活力显著降低，机体存在自由基代谢失衡，脂质过氧化损伤肝组织。本研究中，杞黄葛复方干预后肝细胞中ROS和MDA含量明显降低而SOD含量明显升高，说明杞黄葛复方可抑制ROS的产生，提高SOD的活力，减轻脂质过氧化反应，保护肝细胞。

综上所述，杞黄葛复方可以通过下调肝脏脂质合成途径相关酶和转录因子的表达而影响脂肪酸代谢，减少TG合成；还可以增强细胞抗氧化能力，减轻肝脏脂质过氧化损伤。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。