血府逐瘀汤对非小细胞肺癌荷瘤小鼠GSK-3β与β-catenin表达的影响

王理槐，孙银辉，张领兄，刘 欢，周 琴，袁苏云，张亚茹，朱 乐，张 红

(1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3. 重庆市九龙坡区中医院，重庆 400000)

肺癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在我国都位居恶性肿瘤之首[1]。肺癌的类型以非小细胞肺癌常见，占肺癌的80%以上[2]。中医认为非小细胞肺癌属于“肺积”“咯血”范畴，由于正气虚损、阴阳失调，邪毒外侵入肺，导致痰浊内聚、气滞血虚、肺气郁阻，肺功能失调，日久形成肺部积块。因此，肺癌的主要病机为气滞、血瘀、毒凝[3-4]。血府逐瘀汤具有活血化瘀、行气止痛兼清热的功效，用于中晚期非小细胞肺癌可明显改善血液高凝状态，减轻症状，提高近期疗效[5-6]，但其作用机制不明确。本研究基于与肿瘤发生发展密切相关的Wnt/β-catenin信号通路，观察了血府逐瘀汤对非小细胞肺癌荷瘤小鼠糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)与β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响，探讨其治疗非小细胞肺癌的作用及可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性健康SPF级8周龄C57BL/6小鼠32只，体重(23.16±1.38)g，购于湖南嘉泰实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2020-0006。所有小鼠均于恒温(21～22 ℃)、恒湿(55%～65%)，安静通风的动物饲养室内行适应性饲养(喂食标准饲料和蒸馏水)。

1.2实验细胞 人非小细胞肺癌 A549细胞，购于中国医学科学院细胞库。

1.3实验药物 血府逐瘀汤由湖南中医药大学校医院药剂科提供，组方：桃仁12 g，红花、当归、生地黄、牛膝各9 g，川芎、桔梗各5 g，赤芍、枳壳各6 g，柴胡、甘草各3 g。准确称取剂量，经煎药机煮成汤剂，浓缩成含生药1 g/mL。

1.4实验方法 将人非小细胞肺癌 A549细胞解冻复苏后接种于培养基上，待其培养至对数生长期后用0.25%胰蛋白酶消化，再以1200r/min离心10 min，制成单细胞悬液，磷酸盐缓冲液重悬，并将细胞浓度调整为1×107个/mL。在小鼠右侧腋皮下接种0.2 mL细胞悬液，待肿瘤体积生长至100 mm3左右，将小鼠随机分为4组，每组8只。模型组给予生理盐水5 mL/kg腹腔注射和蒸馏水5 mL/kg灌胃，血府逐瘀汤低、中、高剂量组均在腹腔注射生理盐水5 mL/kg后再分别予以血府逐瘀汤12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg灌胃，均1次/d，连续14 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1瘤重、肿瘤体积、生长抑制率 小鼠脱颈处死后尽量完整剥取肿瘤，称重，计数肿瘤体积和生长抑制率。 肿瘤体积=π×肿瘤组织长径×短径2/6。生长抑制率=(1-治疗组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%。

1.5.2肿瘤组织细胞凋亡率 采用流式细胞术检测：取1/3瘤体组织，用眼科剪剪碎后，以1 000 r/min离心5 min，取细胞悬液，再次离心取细胞沉淀，采用预冷的PBS重悬，采用annexin V碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)，严格按说明书中步骤操作，采用结合缓冲液重悬细胞并避光反应10 min，之后滴加PI，4 ℃孵育30 min。使用BD Accuri C6 (BD Biosciences,San Jose,CA)流式细胞仪，在488 nm的激发下分析细胞早期和晚期凋亡情况。分别在530/30 nm和585/40 nm的发射通道中采集经FITC和PI染色的细胞荧光信号，结果用FCS Express V4软件(De Novo software,Glendale,CA)进行处理。

1.5.3肿瘤组织中GSK-3β与β-catenin蛋白表达情况 采用Western blot检测：提取小鼠肿瘤组织蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜转印，脱脂奶粉室温封闭，分别加入兔源GSK-3β一抗(1∶1 500)、兔源β-catenin一抗(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育，ECL显影，ChemiDoc MP成像。运用Adobe Photoshop CS5软件分析蛋白条带灰度值，β-actin作为内参。

1.5.4肿瘤组织中GSK-3β与β-catenin mRNA表达情况 采用qTR-PCR检测：提取小鼠肿瘤组织，采用组织研磨仪研磨制备细胞悬液。根据组织RNA提取试剂盒提取，参照反转录酶说明书进行反转录合成cDNA，采用qRT-PCR检测，以GAPDH为内参。相关引物序列：GSK-3β 上游引物5’-AGGCTGTGTGTTGGCTGAAT-3’，下游引物5’-TTTGCTCCCTTGTTGGTGTT-3’；β-catenin上游引物5’-GTTACGGCAATCAGGAAAGC-3’，下游引物5’-GACAGACAGCACCTTCAGCA-3’；GAPDH上游引物5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃复性30 s，共循环40次。使用相对量化方程2-ΔΔCt计算相对表达量。

2 结 果

2.1各组小鼠瘤重、肿瘤体积和生长抑制率比较血府逐瘀汤各剂量组瘤重、肿瘤体积均明显低于模型组(P均<0.05)；血府逐瘀汤各剂量组瘤重、肿瘤体积呈剂量依赖性降低，生长抑制率呈剂量依赖性增高，各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组非小细胞肺癌荷瘤小鼠瘤重、肿瘤体积和生长抑制率比较

2.2各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡率比较 血府逐瘀汤各剂量组细胞凋亡率均明显高于模型组(P均<0.05)，且血府逐瘀汤各剂量组细胞凋亡率呈剂量依赖性增高，各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1及图2。

图1 流式细胞术检测各组非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况

图2 各组非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡率

2.3各组小鼠肿瘤组织中GSK-3β与β-catenin蛋白表达情况比较 血府逐瘀汤各剂量组肿瘤组织中GSK-3β蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，β-catenin蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且血府逐瘀汤各剂量组GSK-3β与β-catenin蛋白相对表达量分别呈剂量依赖性增高和降低，各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3及图4。

图3 各组非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织中GSK-3β与β-catenin蛋白表达情况

图4 各组非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织中GSK-3β与β-catenin蛋白相对表达量

2.4各组小鼠GSK-3β与β-catenin mRNA表达量比较 血府逐瘀汤各剂量组肿瘤组织中GSK-3β mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，β-catenin mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，且血府逐瘀汤各剂量组GSK-3β与β-catenin mRNA相对表达量分别呈剂量依赖性增高和降低，各剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图5。

图5 各组非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织中GSK-3β与β-catenin mRNA相对表达量

3 讨 论

中医认为，正气内虚，肺气亏损，外邪侵入，客邪留滞不去，致肺部血瘀气滞，结而成块；或烟毒内侵，热灼津液，阴液内耗，致肺阴亏损，久则气阴亏虚，而致痰湿瘀血凝结；或邪毒侵肺，毒瘀互结，久则形成肿块；或痰湿聚肺，肺气宣降失常，导致气血瘀阻。故而正气内虚、阴阳失调是导致非小细胞肺癌的内因，邪毒内侵是外因，气滞、血瘀、痰凝、毒聚是病理产物[7-8]。血府逐瘀汤方中桃仁、红花破血行气、化瘀止痛；牛膝活血通经，引血下行；赤芍、川芎活血行气，助桃仁、红花活血化瘀止痛；柴胡疏肝解郁，兼升清阳，同桔梗、枳壳共用理气去滞作用尤佳，且可载药上行，使药效达于胸肺；生地、当归养血益阴又具清热之功，避免药性温燥；甘草调和诸药。全方活血化瘀、行气，血行瘀化有利于新血复生，气血和调，改善机体气滞、血瘀、痰凝、毒聚。张岚等[9]报道，生脉饮合血府逐瘀汤加减治疗可明显改善非小细胞肺癌患者血液的高凝状态，可通过下调碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)和血管内皮生长因子(VEGF)水平达到抗肿瘤的效果。本课题组通过制备肺癌荷瘤小鼠模型进行研究，结果显示血府逐瘀汤各剂量组瘤重、肿瘤体积均明显低于模型组，且各剂量组瘤重、肿瘤体积呈剂量依赖性降低，生长抑制率呈剂量依赖性增高。说明血府逐瘀汤能够有效抑制非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长，促进肿瘤细胞凋亡，且作用与血府逐瘀汤剂量有一定关系。

GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路中的一种重要激酶，能够抑制通路的信号传导[10-11]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子，在细胞的增殖、侵袭和凋亡中发挥重要作用[12]。肺癌干细胞中Wnt/β-catenin通路活性上调,GSK-3β表达水平下降,p-GSK3β(Ser9)和β-catenin表达水平上升，GSK-3β能够调控β-catenin在细胞质内的磷酸化和降解，上调GSK-3β有利于抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，促进肺癌细胞发生凋亡[13-14]。方炜等[15]通过检测肺癌组织标本中Wnt、β-catenin、c-myc蛋白及mRNA表达情况发现，Wnt/β-catenin/c-myc通路活化程度与肿瘤分化程度和淋巴结转移间存在密切关系。本实验结果显示，血府逐瘀汤各剂量组肿瘤组织中GSK-3β蛋白及mRNA相对表达量均明显高于模型组，β-catenin蛋白及mRNA相对表达量均明显低于模型组，且各剂量组GSK-3β和β-catenin蛋白及mRNA相对表达量呈剂量依赖性增高和降低。说明血府逐瘀汤能够上调GSK-3β表达，下调β-catenin表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路活性。

综上所述，血府逐瘀汤可能通过上调GSK-3β表达，下调β-catenin表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路活性达到抑制肿瘤组织生长和促进肿瘤细胞凋亡的作用，且作用与血府逐瘀汤剂量有一定关系。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。