益气温阳颗粒联合贝伐珠单抗对肺癌小鼠肿瘤组织微环境的影响

刘 伟，谢莉莹，姜可园，梁绵杰，张慧婷，王雪玭

(1. 天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；2. 天津中医药大学，天津 301617)

据最新全球癌症报告预计，2020年肺癌新发病例为220万(11.4%)，死亡病例为180万(18%)，在全球癌症发病率中位居第二，癌症死亡率中居首，且从全球范围看其存活率仍较低[1]。2010—2014年确诊的肺癌患者年龄标准化5年生存率只有10%～20%[2]。肺癌成为我国发病率与病死率最高的癌症，这不仅严重威胁到人民的生命健康，也给社会造成巨大负担，因此迫切需要找到更好的肺癌治疗方案。贝伐珠单抗作为抑制肿瘤血管生成药物目前已大量应用于临床，可抗血管生成，改善肿瘤微环境，抑制肿瘤发展与转移，但其存在明显的不良反应，且在治疗后期会出现耐药性，可能导致恶性程度更高的肿瘤发生[3-5]。中医中药治疗对恶性肿瘤确有一定疗效，与西药联合应用有减轻不良反应、提高整体疗效的作用。本实验观察了孙增涛教授依据多年临床经验创制的益气温阳颗粒与贝珠伐单抗联合应用对Lewis荷瘤小鼠肿瘤组织微环境的影响，拟从微观环境角度发掘中医药的潜在作用。

1 实验材料和方法

1.1实验动物 C57BL/6J雄性小鼠50只，体重(18±2)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(动物合格证号：1100111911037746)，实验开始前对小鼠进行常规饲料饲养，所有小鼠均可自由进食饮水，饲养环境温度为(22±2)℃， 湿度为 50%～60%。釆用人工控制室内照明，保持12 h光照和黑暗交替循环。

1.2药物 贝伐珠单抗注射液100 mg(4 mL)/瓶，Roche Pharma(Switzerland)Ltd.生产(批准文号：S20120069)；益气温阳颗粒：黄芪20 g、肉苁蓉20 g、淫羊藿20 g、党参15 g、薏苡仁20 g、莪术15 g、虎杖20 g、鸡内金10 g、桔梗10 g、甘草6 g。小鼠的药量计算方式据第3版《药理实验方法学》中“动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”进行折算。

1.3主要实验仪器、试剂 分光光度计(NANODROP 2000，Therno scientific)，荧光定量PCR仪(ABI7500，Applied Biosystems)，显微镜(BX51T-PHD-J11，Olympus Corporation)，多功能真彩色细胞图像分析管理系统(Image-Pro Plus，Media Cybernetics)，Lewis肺癌细胞系(中科院上海细胞保存中心)，Q-PCR 试剂盒(TaKaRa)，超纯RNA提取试剂(TaKaRa)，反转录试剂盒(TaKaRa)，5x RNA Loading Buffer(TaKaRa)，转化生长因子β1(TGF-β1) ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)。

1.4实验方法 将小鼠随机分为正常组、模型组、贝伐珠单抗组、益气温阳组及贝伐珠单抗+益气温阳组，每组10只。除正常组小鼠外，其他组小鼠于右腋窝皮下接种0.2 mL细胞浓度为1×107个/mL的Lewis细胞。接种后3 d，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，0.4 mL/d；贝伐珠单抗组给予贝伐珠单抗15 mg/kg腹腔注射，每周2次；益气温阳组给予20 g/kg的益气温阳颗粒生药灌胃，1次/d；贝伐珠单抗+益气温阳组给予贝伐珠单抗腹腔注射及益气温阳颗粒生药灌胃，给药方法及剂量同贝伐珠单抗组和益气温阳组。

1.5观察指标及方法

1.5.1肿瘤组织病理学观察 第14天给药2 h后将小鼠处死，取出肿瘤组织，予4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡组织包埋、切片(5 μm)，行HE染色，中性树胶封片，光镜下观察。

1.5.2肿瘤组织中低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达检测 石蜡切片脱蜡、入水，1%甲醇双氧水阻断过氧化物酶，10 min，PBS洗5 min×3次，放入柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波炉内微波辐射10 min，降至室温后PBS洗5 min×3次，滴加正常山羊血清封闭液，20 min，滴加一抗，4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×3次，DAB显色，复染，脱水，封片，显微镜观察，图像分析，计算免疫组化评分。免疫组化评分=百分比评分×细胞染色强度评分(评分范围1～12分)。百分比评分标准：阳性细胞计数0～1%记0分，1%～10%记1分，10%～50%记2分，50%～80%记3分，80%～100%记4分；细胞染色强度评分标准：细胞无染色记0分，浅黄色记1分，棕色记2分，棕褐色记3分。

1.5.3肿瘤组织中促红细胞生成素(EPO)和HK1 mRNA表达检测 采用Q-PCR法检测：依据产品说明书用超纯RNA提取试剂提取组织样本总RNA，测定RNA的A260/A280比值，检测RNA完整性，对RNA中残留基因组DNA进行消化处理后进行反转录。引物序列：EPO上游5’-CCCACCCTGCTGCTTTTACT-3’，下游5’-TGCACAACCCATCGTGACAT-3’，产物长度150 bp；HK1-F上游5’-TGTGAGGCTCCAGTAGGACA-3’，下游5’-GGAAAGCATCAGTCCTGGCT-3’，产物长度145 bp；内参β-actin上游5’-GATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3’，下游5’-AGTAACAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，产物长度80 bp。各样品cDNA 10倍稀释后取2 μL，目的基因引物和内参基因引物扩增，60～95 ℃进行溶解曲线分析。反应结束后确认PCR扩增曲线和溶解曲线，所测得值求2-ΔΔCT计算各组基因的相对表达量。

1.5.4血清中TGF-β1水平检测 取各组小鼠血清,严格按照ELISA检测试剂盒说明操作，用标准物浓度与OD值计算出标准曲线直线回归方程式，将样品OD值代入方程式，计算样品实际浓度。

2 结 果

2.1肿瘤组织病理形态 模型组：肿瘤细胞团块状分布，无出血现象，排列紧密，生长旺盛，坏死不明显，大小、形态各异，部分细胞核体积增大，染色较深，数目增多，分布不均，可见巨核、多核，核分裂象增多，可见不对称性、顿挫性等病理性核分裂象，间质内的淋巴细胞少见，可见少量炎细胞浸润，细胞浆出现空泡变异；贝伐珠单抗组：肿瘤细胞变小，少量出血，大量凋亡，散在部分孤立细胞，核分裂象减少，异型性差，出现大量“新月”状细胞核，间质可见中度炎细胞浸润；益气温阳组：肿瘤细胞团块状分布变小，偶有少量出血，排列呈片状且疏松，生长局限，着色浅，可见散在孤立细胞，核分裂象较少，可见“新月”状细胞核，周围可见小灶状细胞坏死及中度炎细胞浸润；贝伐珠单抗+益气温阳组：肿瘤组织边界不清，多处大片状坏死，肿瘤细胞显著减少，碎片易见，多处出血，体积明显缩小，细胞之间排列疏松，大量散在的孤立细胞，核分裂象较少，异型性差，大量炎细胞浸润。见图1。

2.2肿瘤组织中HIF-1α表达免疫组化染色情况模型组阳性细胞数占比为39%～49%(对应颜色为棕褐色)，贝伐珠单抗组阳性细胞数占比为21%～29%(对应颜色为棕色)，益气温阳组阳性细胞数占比为28%～37%(对应颜色以棕褐色为主，带有少量棕色)，贝伐珠单抗+益气温阳组阳性细胞数占比为15%～23%(对应的颜色为浅黄色和棕色)。见图2。

图1 各组肺癌小鼠肿瘤组织HE染色表现(×400)

2.3肿瘤组织中HIF-1α表达IHS评分比较 贝伐珠单抗组、贝伐珠单抗+益气温阳组小鼠肿瘤组织中HIF-1α表达IHS评分均明显低于模型组(P均<0.05)，且贝伐珠单抗+益气温阳组明显低于益气温阳组(P<0.05)，贝伐珠单抗组和益气温阳组、贝伐珠单抗+益气温阳组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

图2 各组肺癌小鼠肿瘤组织中HIF-1α表达免疫组化染色表现(×400)

2.4肿瘤组织中EPO和HK1 mRNA表达情况 贝伐珠单抗组、益气温阳组及贝伐珠单抗+益气温阳组肿瘤组织中EPO mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，贝伐珠单抗组和贝伐珠单抗+益气温阳组均明显低于益气温阳组(P均<0.05)，贝伐珠单抗组与贝伐珠单抗+益气温阳组比较差异无统计学意义(P>0.05)；贝伐珠单抗组和贝伐珠单抗+益气温阳组HK1 mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，各药物组间两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 各组肺癌小鼠肿瘤组织中EPO和HK1 mRNA表达情况

2.5各组血清TGF-β1水平比较 模型组小鼠血清TGF-β1水平明显高于正常组(P<0.05)，贝伐珠单抗组、益气温阳组及贝伐珠单抗+益气温阳组均明显低于模型组(P均<0.05)，贝伐珠单抗组和贝伐珠单抗+益气温阳组均明显低于益气温阳组(P均<0.05)，贝伐珠单抗组与贝伐珠单抗+益气温阳组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 正常组和肺癌各组小鼠血清中TGF-β1水平

3 讨 论

中医虽无“肺癌”之病名，但在历代文献中提到的有关“肺积”“息贲”“咳嗽”“胸痛”等都有类似于肺癌的论述，因此中医在治疗肺癌方面已有一定经验积累。现代中医药学者们多将肺癌责之为“痰、毒、热、瘀”，认为痰毒血瘀、郁结在肺为主要病机，将清热化痰、解毒化瘀作为主要治疗方法，以达到化痰消瘀、散结除积的目的。中医药凭借长久的使用经验、明确的治疗效果、多靶点的作用模式、较少的不良反应等多方面优点，已广泛应用于各种癌症的治疗，与西药联合应用可增强抗癌疗效、减轻西药的不良反应、延缓肿瘤进展，但其发挥疗效的具体作用机制仍有待探究。

肿瘤的发生、发展、转移及其治疗效果离不开肿瘤微环境的影响，肿瘤细胞的能量代谢、免疫逃逸，肿瘤组织的血管生成等诸多方面皆与肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境组成复杂，除肿瘤细胞之外，间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、炎症细胞和细胞外基质等均参与其中[6-8]。随着对肿瘤微环境研究的进一步深入，中医药改善肿瘤微环境的作用也逐渐被重视，成为当前的研究热点。在对相关文献的梳理中，笔者发现中药确有改善肿瘤微环境的作用，如益气温阳类中药、益气活血解毒类中药可抑制肿瘤细胞增殖及转移、抑制肿瘤血管生成、调节机体免疫功能等[9-12]。同时课题组在前期对121例肺结节患者中医体质调查研究中发现，肺结节患者以偏颇体质多见，其中又以气虚体质、阳虚体质为主，且气虚、阳虚体质可能贯穿肺结节患者结节由良性结节发展至肺癌的全过程[13]。据此，本实验在前期研究的基础上探究了益气温阳类成方益气温阳颗粒与西药联合应用对肿瘤微环境的影响。该方以益气温阳散结为法，结合肺癌发病特点，辅以活血消积之药调佐，补而不滞，温而不热，温补消散，祛邪而不伤正，使气血通畅而癥块自消，临床应用效果颇佳。

本次实验主要检测了肿瘤组织中HIF-1α、EPO、HK1表达情况及血清中TGF-β1水平，能够反映出肿瘤组织中缺氧、能量代谢异常、免疫逃逸等多方面问题，各因子之间相互影响，涉及多种细胞及机制通路。其中HIF-1α在多种肿瘤组织中呈高表达状态，在缺氧状态下升高并激活EPO、糖酵解等相关基因表达以适应缺氧环境，介导癌细胞的生长及转移[14-17]。EPO除具有造血作用外，还可影响实体瘤细胞的生长和存活[18]。HK1也在多种肿瘤组织中表达，具有糖酵解及抗细胞凋亡作用，可作为癌症的预后生物标志物[19-21]；且因糖酵解过度活跃所产生的酸性环境会分解破坏细胞基质，致使肿瘤细胞发生免疫逃逸，使肿瘤细胞扩散加速[23-24]。TGF-β1在肿瘤微环境的免疫抑制方面发挥着重要作用，其可促进血管生成，参与诱导细胞凋亡，与化疗耐药、癌症免疫治疗不良反应、放射耐受的发生有关[25-27]。

本实验证实，益气温阳颗粒可以在一定程度上抑制肺癌小鼠肿瘤组织中HIF-1α表达，显著下调肿瘤组织中EPO mRNA表达，降低血清中TGF-β1水平，对HK1 mRNA表达有下调趋势；益气温阳颗粒与贝伐珠单抗联合应用抑制肿瘤组织中HIF-1α和EPO mRNA表达、降低血清中TGF-β1水平的作用较益气温阳颗粒单独应用更明显。证实益气温阳颗粒联合贝伐单抗可明显改善肺癌小鼠肿瘤组织微环境，延缓肿瘤进展，其影响涉及肿瘤组织中包括血管生成、糖酵解、免疫逃逸等多方面，进一步明确了益气温阳颗粒从整体调节出发、增效减毒的多靶点作用。考虑到肿瘤微环境的复杂性，各因子之间存在相互影响，关于中药对于肿瘤微环境的影响及其具体机制还需要深入研究，以给肺癌的治疗研究提供新的思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。