越南伯克霍尔德氏菌B418配合噻唑膦提高对黄瓜根结线虫的防控效果

扈进冬 魏艳丽 王贻莲 刘宝军 李纪顺

〔齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省科学院生态研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东济南 250103〕

根结线虫是世界上危害植物健康最严重的寄生线虫之一，目前已知对5 500 多种植物的生长发育及生产构成威胁，其中包括粮食作物、蔬菜作物及经济作物等（Trudgill &Blok，2001；Jones et al.，2013）。在我国南方根结线虫（）、花生根结线虫（）、爪哇线虫（）和北方根结线虫（）4 种根结线虫分布比例最高（Castagnone-Sereno et al.，2013；Fan et al.，2020）。伴随着我国保护地蔬菜的迅猛发展，黄瓜、番茄等根结线虫危害日趋严重，给农业生产造成了严重损失。北方保护地黄瓜生产中根结线虫以南方根结线虫为主，一旦发生常导致黄瓜严重减产，甚至绝产，是影响黄瓜生产的重要病害之一（彭德良，1998；成惠珍 等，2004；贾美清和吴光红，2011）。然而目前市场上可供选择的杀线剂主要以噻唑膦、阿维菌素、棉隆为主，在很多地方已经产生了严重的抗药性（刘晓艳 等，2021）。农民为了防治根结线虫病，实际的化学杀线剂使用量也逐渐增加，不但增加了防治成本，而且也易产生药害、农药残留和环境污染（纪春涛 等，2010；Davies &Spiegel，2011；Sergio，2011），同时，防治效果和产量也提高有限。由于化学防治的局限性，以及人们环境保护、食品安全意识的提高，生物防治已被认为是化学防治的一种有益补充及替代方法。在生物防治措施中，微生物拮抗剂是一种很有前景的防治植物病害的生物制剂，也越来越受到人们的广泛关注（Sharifazizi et al.，2017；Vega，2018）。目前已报道的植物寄生线虫生防微生物资源有淡紫拟青霉251、坚强芽孢杆菌I-1582、厚垣轮枝孢ZK7（Li et al.，2015）、长枝木霉T6（Zhang et al.，2017）、橘绿木霉Snef 1910（Fan et al.，2020）、越南伯克霍尔德氏菌B418（陈凯 等，2011）等，其中多株优良生防菌株已被开发为生物杀线剂产品。

越南伯克霍尔德氏菌B418 是山东省科学院生态研究所环境微生物研究室保存的一株多功能生防菌株，除具备防治植物根结线虫病的作用，还兼有解磷、解钾、固氮、促生等功能，并已在农业部登记为微生物肥料产品（王贻莲 等，2014）。在以往的试验中主要单独使用，对线虫的防治效果还不甚理想，因此本试验拟通过小区试验测定越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦使用对黄瓜根结线虫的田间防治效果及产量的影响，为黄瓜根结线虫病的科学防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和药剂

越南伯克霍尔德氏菌B418（CGMCC No.1212）由山东省科学院生态研究所环境微生物实验室保存，液体发酵后制备成粉状菌剂（活菌含量5 × 10cfu·g）备用。10%噻唑膦颗粒剂（河北三农农用化工有限公司产品）按1∶9 比例与细沙混合备用。

1.2 土壤样品采集与土壤DNA 提取

2021 年在山东省泰安市岱岳区明泰农丰科技（泰安市）有限公司大棚采集土壤样品，该棚棚龄11 年，土壤类型为棕壤。试验棚划分小区后，每小区按照五点取样法取样，采集0～20 cm 的表层土，将5 点采集的土壤混合均匀作为1 个土样。室温条件下风干，取500 g 风干后土样气流粉碎机粉碎后称取0.5 g 土壤样品，利用DNeasy Power Soil DNA Isolation Kit（Qiagen，Valencia，CA）试剂盒，按照说明书提取土壤DNA，最终洗脱体积为100 μL，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量和浓度后，用于土壤样品中根结线虫的荧光定量PCR检测。

1.3 荧光定量PCR 分析

采用毛小芳等（2004）改良的贝尔曼漏斗法分离土壤中根结线虫二龄幼虫，并在显微镜下挑取1 000 条二龄幼虫，提取线虫基因组DNA，并将其梯度稀释，制成1 000、100、10、1、0.1 条线虫的标准品，根据南方根结线虫的ITS区（NCBI FJ534 516.1）ITS1部分保守序列，设计南方根结线虫特异性引物MIITS7-F（5′-CCAATTTAATCGCAGTGGCTTG）和MIITS 127-R1（5′-CGACAGCCGTTTCACAACAATA）进 行PCR 扩增。依据循环阈值（Cq 值）与根结线虫二龄幼虫的对数值之间的线性关系，建立标准曲线。土壤样品中根结线虫的种群密度根据标准曲线计算获得。

qPCR 采用二步法，扩增反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，共40 个循环；循环结束后，样品加热到95 ℃保持1 min，立刻降至60 ℃保持5 s，然后每5 s 提高0.5 ℃递增到95 ℃，建立熔解曲线。qPCR 反应体系（20 μL）：10 μL 2× SG Fast qPCR Master Mix 预混液〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕，20 μmol·L引物MIITS7-F和MIITS127-R1 各1 μL，DNF Buffer 2 μL，土壤DNA 样品1 μL，超纯水补足20 μL，每个土壤DNA 样品3 次重复。

1.4 防治黄瓜根结线虫的田间试验方案

2020 年11 月至2021 年3 月在泰安市大汶口镇北藤村多年连作种植的黄瓜棚，进行黄瓜根结线虫防治试验，每茬黄瓜根结线虫病株率在90%以上。供试黄瓜品种为金禾1912，购自山东金禾农科种业有限公司。在黄瓜移栽前采用1.2 和1.3 的方法测定各小区土壤中根结线虫的种群密度，并根据土壤中线虫的种群密度将各小区分为线虫轻度、中度和重度小区3 种类型，其中线虫轻度小区8 个，中度小区8 个，重度小区4 个。小区面积13.5 m（9 m × 1.5 m），每小区定植60 株黄瓜。试验共设置4 个处理：越南伯克霍尔德氏菌菌剂（每穴9 g）、10%噻唑膦颗粒剂（每穴3 g）、复合处理（越南伯克霍尔德氏菌菌剂每穴9 g+10%噻唑膦颗粒剂每穴3 g）和空白对照，每处理设置5 个小区，2 个小区在线虫轻度小区，2 个在线虫中度小区，1 个在线虫重度小区，同一类型小区内各处理完全随机排列。在黄瓜定植时，先将越南伯克霍尔德氏菌菌剂和10%噻唑膦颗粒剂施入定植穴内，和定植穴内土壤均匀混合后移栽黄瓜幼苗，定植后各小区管理操作一致，试验期间不施用防治根结线虫的其他药剂。

在黄瓜定植后60 d 每小区随机挖取5 株黄瓜，参照Bridge 和Page（1980）的方法，对各处理根系样品的根结进行分级，并计算根结病情指数和防效（Wei et al.，2014），定植后105 d 将剩余黄瓜植株全部挖出，按前述方法进行根系根结分级并计算根结病情指数和防效。在定植后60 d 和90 d 时分别对各小区进行产量测定，每次测产连续测定3 d，然后将3 d 的产量之和作为1 次测产结果。定植后105 d 随机选取5 株黄瓜，挖取植株根系，并用清水小心冲洗后晾干，记录主根上分出的侧根数量。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2010 软件对数据进行整理、使用SPSS statistics 20.0 统计分析软件进行统计分析，不同处理样品采用Duncan 新复极差法（＜0.05）分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 小区土壤中根结线虫的种群密度

依据Cq 值与根结线虫二龄幼虫的对数值之间的线性关系，建立根结线虫标准曲线（图1）。并据此测定了田间试验中不同处理的25 个小区土壤中根结线虫的种群密度，图2 显示熔解峰单一表明qPCR 产物特异性好，结果可以较好地反映土壤中南方根结线虫的种群数量。本试验测定的小区中每1 kg土壤中的根结线虫数量在15.8～408.4条之间，从25 个小区中选取20 个作为试验小区，选取每1 kg 土壤中的根结线虫数量在0～50 条之间的小区定为线虫轻度小区组，共8 个小区；将每1 kg 土壤中的根结线虫数量在51～200 条之间的小区定为线虫中度小区组，共8 个小区；将每1 kg 土壤中的根结线虫数量在201～400 条之间的小区定为线虫重度小区组，共4 个小区。

图1 南方根结线虫数量对数值与Cq 值间的拟合曲线

图2 土壤基因组DNA 样本qPCR 扩增的熔解曲线

2.2 不同药剂处理对黄瓜根结线虫病的防效

黄瓜定植后60 d 的测定结果表明（表1），在线虫轻度、中度和重度小区中越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理的根结线虫病情指数为1.06～5.20，对根结线虫的平均防效达72.50%，与10%噻唑膦（平均防效68.47%）或单一越南伯克霍尔德氏菌B418 菌剂（平均防效63.29%）施用相比，防效有一定程度的提升，但差异不显著（以单独计算的线虫轻度、中度和重度小区的防效作为重复进行统计，下同）。

黄瓜定植后105 d 的测定结果表明（表1），在线虫轻度、中度和重度小区中越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理的根结线虫病情指数为3.87～13.84，对根结线虫的平均防效达63.99%，与10%噻唑膦（平均防效58.34%）或单一越南伯克霍尔德氏菌B418 菌剂（平均防效57.08%）施用相比，具有显著的增效作用（＜0.05）。

2.3 不同药剂处理对黄瓜产量的影响

不同药剂处理对黄瓜产量的影响如表2 所示，根据定植前土壤线虫种群密度划分的轻度小区、中度小区和重度小区之间黄瓜产量差异非常大。黄瓜定植后60 d 时测产，线虫重度小区对照产量为3.20 kg，低于3 种类型小区对照的平均产量（3.58 kg），而且重度小区的对照病情指数（15.42）也是3 种类型小区中最高的（表1），说明从定植后60 d开始根结线虫已经对黄瓜产量产生影响。至定植后90 d 时，线虫重度小区对照的产量仅为0.65 kg，说明根结线虫已严重影响产量。越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理则可以更好地降低根结线虫对黄瓜产量造成的损失，在定植后60 d 时，越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理与对照相比增产48.10%～101.56%，在定植后90 d 时增产达95.65%～392.31%，其增产效果明显优于单一越南伯克霍尔德氏菌B418 或单一噻唑膦处理；在定植后60、90 d 时增产率分别较单一噻唑膦处理提高8.86～71.87 百分点和21.74～230.77 百分点，在线虫重度小区增产尤为明显。说明越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理具有协同增效作用，在防治根结线虫病的同时能有效减少线虫危害造成的黄瓜产量损失。

表1 不同药剂处理对黄瓜根结线虫病情指数和防效的影响

表2 不同药剂处理对黄瓜产量的影响

2.4 不同药剂处理对黄瓜根系的影响

在定植后105 d 时从不同处理组中随机挑选5株黄瓜，如图3 所示，越南伯克霍尔德氏菌B418配合噻唑膦处理的根系侧根明显增多。其中，对照平均侧根数5.1 条·根，但根结数较多；噻唑膦处理虽然根结数比对照少但平均侧根数仅为4.2 条·根；越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理的平均侧根数则为10.4 条·根，同时根结数也比对照少；单一越南伯克霍尔德氏菌B418 处理平均侧根数为6.2 条·根，根结数介于对照和越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理组之间。说明虽然噻唑膦处理可以有效防治根结线虫，但同时也会影响植株的根系生长发育，从而影响黄瓜产量，而越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦处理则可以改善单一噻唑膦处理对植株生长的这种负面影响，有助于黄瓜产量的提高。

图3 定植后105 d 不同处理对黄瓜根系的影响

3 结论与讨论

本试验针对土壤中线虫种群密度分布不均匀的问题，改进了小区试验的随机区组设计，首先采用qPCR 测定了每个小区土壤中根结线虫数量，并按土壤中根结线虫的种群密度将小区划分为线虫轻度、中度、重度3 个不同等级；然后，再将不同处理随机排列到不同等级小区中，病情指数和防效在同等级小区内测定，克服了直接随机排列可能出现的不同处理的小区线虫种群密度差异大对结果造成的不利影响。以对照为例，从表1 的结果可以看出，2 个线虫轻度小区黄瓜定植后105 d 时对照的病情指数为12.05 和25.28，而线虫重度小区则为38.24，差距较大。这也说明即使在同一蔬菜大棚中，根结线虫的发生也常不均一，呈岛状分布。所以，按土壤中根结线虫的种群密度将小区划分成不同等级，同等级小区之间进行比较结果才更准确。此外，纪春涛等（2010）发现化学杀线剂虽然可以减少线虫对植株的为害，但也会对植株根系发育造成影响，从图3 可以看出，噻唑膦处理后植株侧根数量明显比对照及使用生防菌剂的处理少，因此，植株营养吸收也会相应减弱，表2 的产量结果也进一步印证了上述结果，在黄瓜定植后90 d 时噻唑膦处理组产量明显低于越南伯克霍尔德氏菌B418配合噻唑膦处理组，在线虫重度小区上述趋势尤为明显。

综上所述，采用越南伯克霍尔德氏菌B418 配合噻唑膦防治黄瓜根结线虫病，与单一噻唑膦处理或单一越南伯克霍尔德氏菌B418 处理相比，在不同线虫种群密度小区中均显示出更佳的防病和增产效果，具有协同增效作用，不但增强了对黄瓜根结线虫病的防治效果，还促进了植株根系发育，提高了黄瓜产量。