微生物的耐酸驯化及其对低pH值地浸铀矿山地下水修复的影响

张燕斌,王永东,胡 南,仇晓钰,丁德馨*

(1.铀矿冶生物技术国防重点学科实验室,湖南 衡阳 421001;2.南华大学 极贫铀资源 绿色开发技术湖南省重点实验室,湖南 衡阳 421001)

0 引 言

1 材料与方法

1.1 菌种和低pH值地浸铀矿山地下水样品

1.1.1 菌种

实验的所用的菌种为琼氏不动杆菌(AcinetobacterJunii)和伯克霍尔德菌(Burkholderiasp)，购自中国菌种保藏中心。

1.1.2 低pH值地浸铀矿山地下水

低pH值地浸铀矿山地下水样品取自新疆某地浸铀矿山，pH值为3.0，其主要污染物的种类和含量见表1。

表1 新疆某地浸铀矿山地下水主要物质的种类和含量Table 1 Types and contents of main substances in groundwater of an in-situ leaching uranium mine in Xinjiang 单位：mg·L-1

1.2 菌种的扩大培养

琼氏不动杆菌和伯克霍尔德菌的扩大培养均采用LB培养基，其配方如下：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值为7.0，121 ℃高压灭菌20 min后备用。

将培养基置于培养装置中(见图1)，然后按2%的体积比接种菌悬液，往广口瓶中通氮气50 min后密封瓶口，将其置于恒温箱内静置培养，培养温度为30 ℃。

图1 培养装置Fig.1 Cultivation device

1.3 微生物的耐酸驯化

将低pH值地浸铀矿山地下水过滤除菌，将其pH值调整为7.0，按2%的体积比分别接种琼氏不动杆菌和伯克霍尔德菌，在恒温箱内进行厌氧培养，温度设置为30 ℃。培养过程中每隔4 h测定OD600值，待其达到对数生长期后取菌悬液按2%的体积比接种到pH值为6.0的经过滤除菌的低pH值地浸铀矿山地下水中，然后依次按照pH值5.0、4.0和3.0的顺序进行梯度驯化。为稳定驯化菌的耐酸性能，在每个pH值均转接驯化3次，接种的菌悬液均为上一次驯化的对数期菌悬液。

1.4 驯化前后琼氏不动杆菌的生长特性及其去除的性能变化

1.5 驯化前后伯克霍尔德菌的生长特性及其水解植酸钠的性能变化

1.6 统计分析

本实验采用SPSS 26.0对数据进行统计分析，数据采用t检验(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 菌种驯化

由表2与表3可知，驯化过程中，随着pH的降低，琼氏不动杆菌和伯克霍尔德菌生长到对数期的时间也逐渐延长，但在同一pH值下进行第2次和第3次转接驯化时，两株细菌的生长速度较第1次驯化明显提高。采用在pH为3.0驯化得到的菌株开展后续研究。

表2 pH值和驯化次数对琼氏不动杆菌生长的影响Table 2 The influence of pH value and the number of acclimatization on the growth of Acinetobacter janesi 单位：h

表3 pH值和驯化次数对伯克霍尔德菌生长的影响Table 3 The influence of pH value and the number of acclimatization on the growth of Burkholderia 单位：h

2.2 微生物在不同pH值条件下的生长特性

2.2.1 琼氏不动杆菌在不同pH值条件下的生长特性

如图2所示，在pH为7.0和6.0时，琼氏不动杆菌原始菌株的迟缓期短，琼氏不动杆菌能够快速进入对数生长期，其OD600值最高分别达到0.98、0.88。而当pH为5.0和4.0时，琼氏不动杆菌的生长速度变缓，迟缓期变长，分别为25 h和33 h，其OD600值最高分别为0.56、0.36。当pH为3.0时，琼氏不动杆菌的迟缓期达到60 h以上，且其OD600值最高仅为0.10。

图2 驯化前后的琼氏不动杆菌在不同pH值地浸铀矿山地下水中的生长情况Fig.2 The growth of Acinetobacter joneii in the groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values before and after domestication

琼氏不动杆菌驯化菌株在pH值为4.0至7.0时，其生物量与原始菌株相比没有明显变化。但在pH为3.0至5.0时，琼氏不动杆菌驯化菌株进入对数生长期的时间比原始菌株提前10 h以上。当pH值为3.0时，琼氏不动杆菌驯化菌株的OD600值最高为0.25，与原始菌株相比有明显提高(P<0.05)。

2.2.2 伯克霍尔德菌在不同pH值条件下的生长特性

如图3所示，在pH为7.0和6.0时，伯克霍尔德菌原始菌株的迟缓期分别为12 h、19 h，其OD600值最高分别为0.98、0.82。而当pH为5.0和4.0时，伯克霍尔德菌的生长速度变缓，迟缓期变长，分别为23 h和41 h，其OD600值最高分别为0.57、0.39。当pH为3.0时，伯克霍尔德菌几乎不生长，且其OD600值最高仅为0.02。

图3 驯化前后的伯克霍尔德菌在不同pH值地浸铀矿山地下水中的生长情况Fig.3 The growth of Burkholderia spp before and after domestication in the groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

驯化后，在pH为7.0和6.0时，伯克霍尔德菌驯化菌株的迟缓期缩短，分别为6 h、9 h,其OD600值最高分别为0.98、0.86。当pH为5.0和4.0时，伯克霍尔德菌的迟缓期分别为22 h和40 h，与原始菌株无明显区别，其OD600值最高分别为0.68、0.50。当pH为3.0时，伯克霍尔德菌的迟缓期为67 h，且其OD600值最高为0.36，与原始菌株相比有明显提高(P<0.05)。

琼氏不动杆菌能还原硝酸盐，可用于含硝酸盐水体的修复。而伯克霍尔德菌是一种解磷菌，可以将植酸盐水解，生成正磷酸盐。正磷酸盐能与铀结合生成微溶矿物，从而达到去除水体中铀的目的。地浸矿山地下水含有较高浓度的硝酸盐和铀，可以考虑采用这两种细菌进行修复。但这两种细菌的最适生长pH值均为7.0左右，在低pH值条件下，其生长会受到抑制。pH值对微生物生长繁殖的影响有以下几个方面：一是影响酶的活性，当pH值过低会抑制菌体中某些酶的活性，进而阻碍菌体的新陈代谢；二是影响微生物细胞膜所带电荷的状态，通过改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及对代谢产物的排泄；三是pH值不同，会引起菌体代谢过程的不同，从而使代谢产物的质量和比例发生改变[19]。地浸铀矿山地下水的pH值通常较低，不利于细菌的生长。如本研究中的地浸铀矿山地下水的pH值为3.0，琼氏不动杆菌在此pH值条件下生长时的生物量仅为pH为7.0时的1/10。

菌种驯化一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法。通过驯化可以得到具有较高耐受力及活动能力的菌株。本试验通过耐酸驯化使琼氏不动杆菌和伯克霍尔德菌适应低pH值的环境。细胞膜是微生物在低pH环境中生理胁迫的首要侵袭目标，细胞膜中脂肪酸的组成和比例的变化是其对外部环境胁迫的一般性应答。经过梯度耐酸驯化，微生物细胞膜中单不饱和脂肪酸的含量和碳链长度比例增加，降低了细胞膜对H+的透过性，防止细胞膜内的pH迅速下降，以维持细胞正常的生理功能[20]，从而能够在低pH值的环境中生存。本研究的结果也证明了采取驯化方法可以提高琼氏不动杆菌和伯克霍尔德菌对低pH值环境的适应能力。

2.3 驯化前后琼氏不动杆菌去除的性能变化

图4 驯化前后琼氏不动杆菌对不同pH值 地浸铀矿山地下水中的去除率Fig.4 Nitrate removal rate of Acinetobacter joneii before and after domestication in groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

2.4 驯化前后伯克霍尔德菌的生长特性及其水解植酸钠的性能变化

如图5所示，在pH为7.0时，伯克霍尔德菌原始菌株的植酸钠水解率为79.45%；在pH为6.0、5.0时，伯克霍尔德菌的植酸钠水解率分别下降到41.35%、26.32%；在pH为4.0时，伯克霍尔德菌的植酸钠水解率为5.36%；在pH为3.0时，伯克霍尔德菌植酸钠水解率仅为0.2%。

图5 驯化前后伯克霍尔德菌对不同pH值 地浸铀矿山地下水中植酸钠的水解率Fig.5 The hydrolysis rate of Burkholderia spp. before and after domestication on sodium phytate in groundwater of in-situ leaching uranium mines with different pH values

驯化后，伯克霍尔德菌在pH为7.0时，植酸钠水解率提高到83.71%；在pH为6.0、5.0时，伯克霍尔德菌的植酸钠水解率分别提高到45.36%、30.21%；在pH为4.0时，伯克霍尔德菌的植酸钠水解率提高到16.71%；在pH为3.0时,伯克霍尔德菌植酸钠水解率为9.73%。

在相同pH值的条件下，伯克霍尔德菌驯化菌株的植酸钠水解率始终高于原始菌株。此外，随着pH值的减小，驯化菌株与原始菌株植酸钠水解能力的差异越来越大。在pH为3.0时，驯化菌株植酸钠水解率提高了约47.6倍，且与原始组菌株植酸钠水解能力相比具有显著差异(P<0.05)。以上结果表明，通过驯化，伯克霍尔德菌在pH为3.0的地浸铀矿山地下水中水解植酸钠的能力得到了显著提高。

3 结 论