高海拔地区结核分枝杆菌耐药特征研究

蒋明霞，王兆芬，马斌忠，晁秀珍，王 蓉，马永成，张祖豪，王朝才，李尔琛，魏於家，李 斌

结核病(tuberculosis，TB)是严重危害人类健康的慢性传染性疾病，是国家重大防控传染病之一。据2020年世界卫生组织报告，2019年全球新发结核病患者约1 000万例，其中有46.5万利福平耐药患者，其中78%为耐多药结核病。中国新发及复发结核病患者约72.8万例，在新发结核病中耐多药和(或)耐利福平结核病(MDR/RR-TB)患者占比7.1%，复治结核病中预计占比21%[1]。全国第5次结核病流行病学抽样调查报告显示我国结核病总耐药率为36.8%，耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)为6.8%，我国结核病患病率呈现西部高于中部、中部高于东部的特征较高。青海省地处青藏高原东北部，平均海拔3 000 m以上，常年平均气温在-5.1～9.0 ℃，形成了独特的高寒缺氧环境。为掌握青海省高寒缺氧环境结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)耐药结核病的流性特征及耐药谱，笔者对收集的青海省1 531株结核分枝杆菌进行了耐药特征研究。

1 资料与方法

1.1 菌株收集 2014-2019年，青海省疾病预防控制中心结核病参比实验室收集8个市/州级结核病实验室分离培养阳性的菌株，进行抗结核药物敏感性试验和菌种鉴定的菌株，最终经菌种鉴定的结核分枝杆菌(MTB)1 531株。其中2014年1 151株、2015年130株、2016年108株、2017年201株、2018年388株、2019年553株；西宁市497株、海东市458株、海北州44株、海南州172株、海西州206株、黄南州98株、玉树州44株、果洛州12株；男性859株，女性672株，男女比例1.28∶1；年龄分布在10～92岁，平均年龄(48.67±19.36)岁。

1.2 菌株分离 依据《分枝杆菌分离培养标准化程序及质量保证手册》[3]，应用改良罗氏培养基进行痰分枝杆菌分离培养。痰标本采用4% NaOH去污染处理后直接接种至酸性罗氏固体培养基上，接种后第3 d和第7 d观察培养情况，然后每周观察1次，直到第8周末。

1.3 药敏试验 依据《分枝杆菌药物敏感性实验标准化操作程序及质量保证手册》[4]比例法，对异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、链霉素(streptomycin，SM)、卡那霉素(kanamycin，KM)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)6种常用抗结核药物进行敏感性测定。结果判断标准：含药培养基与对照培养基表面菌落数之比≥0.01判断为耐药。

1.4 菌株鉴定 分离株在进行药物敏感性测定的同时，利用对硝基苯甲酸(PNB)培养基生长试验鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，排除非结核分枝杆菌。

1.5 质量控制 每批试验均以结核分枝杆菌H37Rv作为对照质控。省级结核病参比实验室人员和市"州级结核病实验室人员每年均参加国家结核病参比实验室组织的全国抗结核药物敏感性试验熟练度测试并获得优秀和合格证书，保证实验室检测的标准性和质量。

1.6 耐药结核(DR-TB)评判标准 单耐药结核病(mono-resistant tuberculosis,MR-TB)、多耐药结核病(poly-resistant tuberculosis,PDR-TB)、耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)、准广泛耐药结核病(pre-extensively drug-resistant Tuberculosis,Pre-XDRTB)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)、利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB)6种耐药类型,参考中国防痨协会《耐药结核病化学治疗指南(2019年简版)》[5]的标准。

1.7 统计学分析 所有信息采用Excel2010软件建立数据库，采用SPSS18.0统计软件对数据进行统计分析，计数资料采用“率(%)”表示，以χ2检验对组间差异进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 耐药基本情况 1 531株菌中全敏感菌株1 026株，耐药菌株505株，TDR(Total resistance，总耐药)率32.98%(505/1 531)，MR(mono-resistant，单耐药)率12.34%(189/1 531)，PDR(poly-resistant，多耐药)率5.75%(88/1 531)，MDR(multiarug-resistant，耐多药)率14.89%(228/1 531)，XDR(extensively drug-resistant，广泛耐药)率1.11%(17/1 531)，RR(rifampicin-resistant，利福平耐药)率18.16%(278/1 531)。不同年份MR率2016年最高，PDR率2014年最高，MDR率2014年和2015年相近，RR率2015年最高，XDR率2016年最高，TDR率2014年最高，总体呈逐年下降趋势。见表1。

不同地区菌株不同耐药类型的耐药率差异均有统计学意义(均P<0.05)。MR率黄南州最高，PDR率海东市最高，MDR率、RR率和TDR率海北州最高，XDR率海东市最高。见表2。

表1 青海省2014-2019年1 531株MTB耐药类型分布与耐药率[n(%)]Tab.1 Distribution and drug resistance rate of 1 531 cases of M.tb in Qinghai Province from 2016 to 2019 [n(%)]

表2 1 531株MTB不同地区耐药类型分布与耐药率[n(%)]Tab.2 Distribution and drug resistance rate of 1 531 cases of M.tb in different areas [n(%)]

2.2 初治、复治患者与菌株耐药类型分布 初治患者1 204株，耐药297株。复治患者327株，耐药208株。初、复治患者MR率、PDR率、MDR率、XDR率、RR率、TDR率差异均有统计学意义(均P<0.05)。且MR率初治患者高于复治患者，PDR率、MDR率、XDR率、RR率、TDR率均复治患者明显高于初治患者。见表3。

表3 初、复治患者1 531株MTB耐药类型分布与耐药率[n (%)]Tab.3 Distribution of drug resistance types and drug resistance rate of 1 531 MTB from primary and secondary treatment patients [n (%)]

2.3 对不同抗结核药物的耐药情况 分离的菌株对6种抗结核药物的任何一种耐药率由高到低依次为：INH 23.51%(360/1 531)>SM 20.12%(308/1 531)>RFP 18.16%(278/1 531)>EMB 9.54%(146/1 531)>OFX 7.38%(113/1 531)>KM 2.74%(42/1 531)。见表4。

表4 1 531株MTB患者分离株的耐药率[n(%)]Tab.4 Any drug resistance rate of 1 531 isolated strains from TB patients [n(%)]

2.4 1 531株MTB耐药谱 单耐药谱构成比结果显示：SM 43.39%>INH 31.75%>RFP 21.69%>EMB 3.17%，见表5。多耐药谱共7种类型，构成比结果显示同时耐INH、SM占比最高，见表6。耐多药谱共16种类型，结果显示同时耐INH、RFP、SM、EMB占比最高，MDR-TB >Pre-XDRTB >XDR-TB，见表7。

表5 189株MTB患者分离株单耐药谱Tab.5 Mono Drug-resistant spectrum of 189 isolated strains from TB patients

表6 88株MTB患者分离株多耐药谱Tab.6 Ploy Drug-resistant spectrum of 88 MTB isolated strains

表7 228株MTB患者分离株耐多药谱Tab.7 MDR Drug-resistant spectrum of 228 MTB isolated strains

2.5 人群特征与菌株耐药类型分布 6种抗结核药物敏感性试验结果显示TDR率男性高于女性；青年组高于中、老年组；民族由高到低依次为汉族、回族、其他民族、藏族，差异有统计学意义(χ2=3 078.00，P<0.05)。见表8。

表8 人群特征与菌株耐药类型分布[n(%)]Tab.8 Distribution of population characteristics and drug resistance types [n(%)]

3 讨 论

结核病目前仍然是危害人类健康的重大传染病之一,耐多药和广泛耐药结核病的出现,使全球结核病控制形势变得更加严峻。在全球30个结核病高负担国家中,中国估算结核病发病率排第28位，高于俄罗斯(50/10万)和巴西(46/10万)。中国的结核病死亡数估算为3.1万，结核病死亡率为2.2/10万，结核病死亡率首次降至30个高负担国家的末位[6]，耐药结核病继续成为公共卫生重大威胁。因此，了解DR-TB的耐药分布是控制结核病的基础和有效手段。

研究结果显示，1 531株MTB中 TDR率32.98%，MDR率14.89%、XDR率1.11%。初治患者TDR率24.67%、MDR率7.39%、XDR率0.75%；复治患者TDR率63.60%、MDR率42.51%、XDR率2.45%，高于2007-2008年全国结核病耐药性基线调查报告结果总MDR率为8.32%、XDR率0.68%；初治患者总MDR率5.71%、XDR率0.47%，复治患者TDR率55.17%、总MDR率25.64%、XDR率2.06%[7]。据低海拔地区文献报道[8-11]，TDR率、MDR率均低于青海省，湖南省2014-2018年耐药监测TDR率、MDR率为17.2%、5.1%，四川省2016-2017年耐药监测TDR率、MDR率为23.98%、8.14%，上海市2013-2017年TDR率、MDR率为21.03%、4.98%,海南省2011-2018年TDR率、MDR率为25.85%、11.97%。可能原因与海拔高度和地域生活习惯有关。同时，本次研究初治患者TDR率24.7%、复治患者TDR率63.6%均高于王蓉等[12]的研究结果(初治患者的TDR率12.09%、复治患者的TDR率21.31%)。可能的原因：一是根据国家和青海省“十三五”规划要求实验室诊断技术得以扩展和提升，加强了对耐药结核病的诊断，随之耐药病人发现增多。其次，农牧民对结核防治认识不足，梁军等[13]对青海农牧区居民的结核防治行为倾向调查显示，如果有类似肺结核的症状，约40.00%的人选择扛着或不就医，高达10.00%的人表示不知道如何处理，农牧民对结核防治认识不足、就医不及时、患者自行买药或不按照抗结核治疗规则服药，这些因素都极易导致抗结核治疗失败，并有可能产生耐药性。复治患者耐多药率远高于初治患者，原因可能一方面与长期服用以异烟肼和利福平为主要抗结核药物有关，增加了MTB的耐药性的产生;另一方面可能地处偏远，经济条件相对比较落后，很多农牧民在发现得了结核病后在药店自行购买药物，症状有所缓解后便停药，服药很不规范;当知道结核病免费的政策后到疾控中心(或定点医院)就诊，也不能按时服药，造成大量耐药患者的发生[12]。

研究结果显示，初治患者分离菌株的RR率10.80%，复治患者RR率45.26%，高于国内两次基线调查和全球初、复治RR率。我国2007-2008年和2013年两次全国结核病耐药性基线调查结果显示：2007-2008年初治涂阳肺结核患者RR率6.7%，复治涂阳肺结核患者RR率29.4%；2013年初治涂阳肺结核患者RR率7.1%，复治涂阳肺结核患者RR率24%，高于全球初治和复治涂阳肺结核患者RR率(3.6%、17.0%)[5]。RR-TB涵盖所有对RFP耐药的情况，包括单耐药、耐多药、多耐药和广泛耐药[14]。据WHO 2020年全球结核病报告，在全球30个耐多药结核病高负担国家中，根据估算结核病发病数计算的利福平耐药结核病患者数最多的为印度(12.4万,占全球27%)、中国(6.5万，占全球14%)和俄罗斯(3.9万，占全球8%)。中国新发结核病患者中有7.1%的耐药/耐多药结核病患者，23%的复治耐药/耐多药结核病患者，耐多药结核病占利福平耐药结核病患者的74%[6]。因此，笔者认为在今后的工作中更应该重视MDR-TB/RR-TB的防控，保证政府承诺，加强耐药结核病患者的归口管理，规范合理临床用药，早发现、早诊疗，有效阻止MDR-TB/RR-TB的传播，减少DR-TB的产生。

研究结果显示，不同年份、不同耐药类型耐药率差异有统计学意义，2014-2016年明显高于2017-2019年。可能的原因是2014-2016年间收集菌株多为达米恩耐多药防治项目和全球基金耐多药防治项目，且之前青海省未系统开展全省结核病耐药筛查工作。自2017年开始常规开展全省耐药筛查工作，不同耐药类型耐药率呈下降趋势，不同地区分离菌株的TDR率、RR率差异均有统计学意义。玉树州、果洛州总耐药率、利福平耐药率均低于我省其它市、州，海北州高于我省其它市、州。可能的原因：首先，藏区多为游牧民族，交通不便，样本收集较为困难，所以本次样本量较小。其次，受藏区宗教文化的影响，牧民得病后会相信活佛能医治疾病，不及时就医，造成样本收集量较小。所以，本次研究海北州、玉树州、果洛州数据不能真正代表这3个州的真实耐药情况。

研究结果发现，青海省DR-TB耐药谱较为复杂而广泛，任何耐药率和单耐药谱、多耐药谱、耐多药谱构成比高于2013年全国结核病耐药性基线调查结果[15]。多耐药组合模式6种，耐多药组合模式14种与2013年全国结核病耐药性基线调查结果基本相似。国内外研究表明[16-17]，既往TB 治疗是产生MDR-TB的危险因素。临床治疗前应该重视初治患者的耐药检测，及早发现DR-TB，制定合理的化疗方案，减少获得性耐药菌株的产生。

耐药结核分枝杆菌流行因素多而复杂，居住地为农村、文化程度为初中及以下、当地医疗水平、患者家庭收入、治疗不规范、年龄、性别等均是结核分枝杆菌产生耐药性的危险因素[18-20]。本次研究从人口学特征来看，不同性别、不同民族、不同年龄组间耐药率的差异均有统计学意义。不同性别、年龄组的总耐药率男性高于女性，青年组高于中老年组。不同民族总耐药率由高到低依次为汉族、回族、其他民族、藏族，这可能与患者个人经济水平及常住地医疗资源可及性有关，个人经济水平较高、医疗资源可及性较强，那么就容易购买到抗结核病药品，并且自行服药、断药、反复治疗，导致耐药产生。

本研究中XDR率可能比实际情况略低，因为二线药物在本次实验中只选择OFX和KM两种，MDR-TB还可能对其他未测二线药物耐药，而使XDR-TB未检测出,造成其比率可能比实际低。

总之，青海省DR-TB高于全国水平，在今后的工作中应加强政府承诺，加强DR-TB的发现和治疗工作，尤其应该重视初治患者的耐药检测，及早发现DR-TB，制定合理的化疗方案尽早治疗，减少MDR-TB的产生和传播。