30株牛源分枝杆菌分离株基因分型鉴定

邓可新，王晓平，宋孚洋，严 娜，张 旭，邓光存

牛结核病(Bovine Tuberculosis,bTB)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)引起的一种人兽共患传染病，给养殖业和公共卫生造成了巨大威胁[1]。该病可通过病牛咳嗽喷出的飞沫或空气中的带菌尘埃经呼吸道传播，也可通过摄取带菌的食物和饮水经消化道传播[2]。研究表明，牛和其它动物可以通过人感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)[3]。更重要的是，据报道，在一些发展中国家，约10%的人结核病是由牛分枝杆菌引起的[4]。由于人类和牛的关系密切，因此，检测和监控牛群中的牛结核病对人类健康具有重要意义。

目前，研究牛分枝杆菌的基因型方法以基于PCR的分型方法为主，包括以插入序列 6110-限制性片段长度多态性分析(Insertion sequence 6110-restriction fragment length polymorphism,IS6110-RFLP)、间隔区寡核苷酸序列多态性(spoligotyping)分型法、利用数目可变串联重复序列分析(variable number of tandem repeats,VNTR)、分枝杆菌散在分布重复单元 (Mycobacterial interspersed repetitive unit,MIRU)分型法等[5]。IS6110-RFLP方法操作繁琐，不易数字化，不利于各实验室的比较[6]；spoligotyping方法分型速度快，但是具有局限性，分型不够充分[7]。MIRU-VNTR 方法是应用最广泛的，包括精确的串联重复(ETRs)、分枝杆菌散在重复单元(MIRUs)、可变数目串联重复(VNTRs)和QUBs 位点[8]。不同的MIRU-VNTR 位点组合则更适合地域性牛分枝杆菌分子流行病学研究，对分析病原的遗传特征，阐述结核病的发病机制，追踪传染源、传播途径以及确定防控策略等具有重要意义[9]。

本研究对我国西北三地奶牛场中 PPD 阳性奶牛的分枝杆菌分离株，采用16S rRNA、MPT64以及多位点PCR方法进行菌株分型鉴定，并利用 MIRU-VNTR 基因分型技术了解其基因型及分布特征，以期为奶牛场牛结核病的防控和促进养牛业健康发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 30株临床分离株通过鼻拭子(23株)和咽拭子(7株)采集的方法从甘肃、新疆和宁夏的规模化奶牛场采集(3株采自甘肃,6株采自宁夏，其余21株采自新疆)，并置于-80 ℃冰箱冻存。结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC-27294)：由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

1.2 主要实验试剂以及仪器设备

1.2.1 试剂 改良罗氏培养基(海博，中国)；G+细菌基因组DNA提取试剂盒(庄盟，中国)；2×Power Taq MasterMix(康为世纪，中国)；GelRed核酸染料(Biotium公司，美国)；TAE缓冲液(50×)(索莱宝，中国)；100 bp DNA Ladder(Thermo公司，美国)；2 000 bp DNA Ladder(Thermo公司，美国)；TE缓冲液(天根，中国)。

1.2.2 仪器 NanoDrop 8000(美国Thermo公司)；水平电泳槽(美国BIO-RAD公司)；PCR仪(美国BIO-RAD公司)；凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 牛源临床分离株的培养 将分离株均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，放入37 ℃恒温培养箱内培养4周后，培养基斜面上出现菜花样菌落，然后在罗氏培养基上传代培养4～8周后，将菌种灭活置于-80 ℃冰箱内保存。

1.4 细菌基因组DNA的提取 使用G+细菌基因组DNA提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，中国)对分离株基因组DNA进行提取，并采用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。

1.5 细菌的PCR分析鉴定 采用16S rRNA基因、MTP64基因和分枝杆菌复合种群鉴定基因16S rRNA、MPT64、Rv3349、Rv0577、Rv1510、RV3877/8、Rv1970、Rv3120多位点基因对分离株进行菌株种属鉴定(引物序列见表1)。PCR反应体系(20 μL)：2×Power Taq MasterMix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板(10 μmol/L)1 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性 1 min，60 ℃退火1 min和72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃充分延伸 10 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳(100 V)电泳30 min鉴定，以标准菌株H37Rv作为阳性对照，以2 000 bp DNA Marker作为分子量参照物。采用Image Lab 软件(BIO-RAD，美国)对凝胶图像进行分析，结果判定依据标准见表2。

表1 牛源分枝杆菌多位点分型引物及MIRU-VNTR引物表Tab.1 Multi-locus typing primers for Mycobacterium bovine and MIRU-VNTR primers

1.6 MIRU-VNTR分析 采用 15 位点MIRU-VNTR 对分离株进行基因分型研究，各位点引物序列详见表 1。PCR反应体系(10 μL)：2×Taq Master Mix 5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各1 μL;DNA 模板1 μL;ddH2O 1 μL;DMSO 1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 1 min，Tm温度退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，40 个循环；72 ℃充分延伸 10 min。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳(100 V)电泳40 min鉴定，以100 bp DNA marker作为分子量参照物，以标准菌株 H37Rv作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照，采用BIO-RAD 凝胶成像仪分析凝胶图像，通过拷贝数计算公式得到待检菌株各位点的重复次数。

1.7 VNTR拷贝数结果分析 采用凝胶成像系统配套的 Image Lab 软件对本电泳结果进行分析。根据MIRU-VNTR拷贝数计算公式进行判定：R=Rc+(Mx-Mc)/U，其中，Rc：标准菌株(H37Rv)在该位点的重复序列拷贝数；R：待检菌株在该位点重复序列的拷贝数；Mx：待测菌株在该位点的分子量大小；Mc：参照菌株(H37Rv)在该位点的分子量大小；U：该位点的重复序列的碱基数。使用SPSS软件分析拷贝数结果，定义：若分枝杆菌分离株具有完全相同MIRU-VNTR基因型且≥2株，认为成簇。

成簇率计算公式：成簇率=(NC-C)/N×100%，其中，N：代表结核分枝杆菌分离株总数；C：代表结核分枝杆菌分离株所形成的簇数；Nc：代表成簇的结核分枝杆菌分离株总数。成簇率可以评价某地区菌株的近期传播情况。

1.8 统计学分析 采用SPSS 25.0软件的系统聚类功能对结果进行统计分析。

2 结 果

2.1 牛源临床分离株的培养结果 30株临床株在罗氏培养基内生长状态良好，菌落呈干燥不透明的米黄色菜花样菌落。

2.2 牛源临床分离株的PCR分型鉴定 以结核分枝杆菌标准株 H37Rv核酸为阳性对照，ddH2O为阴性对照，合成分枝杆菌属16S rRNA特异性引物。通过PCR技术鉴定30株牛源临床分离株16SrRNA序列。结果显示，30株分离株16SrRNAPCR产物均扩增出阳性条带。进一步将产物测序，并将测序结果进行同源性比对，一致性为100%，表明30株牛源临床分离株均为分枝杆菌(图1A)。

注:A为16S rRNA扩增结果,目的片段:543 bp;B为MPT64扩增结果,目的片段240 bp;M为2 000 bp DNA Marker;NC为阴性对照(以dd水为PCR模板);PC为阳性对照(以标准株 H37Rv DNA为模板)。图1 牛源分枝杆菌临床株16S rRNA及MPT64扩增结果Fig.1 Results of amplification of clinical strain 16S rRNA and MPT64 of Mycobacterium bovine

以结核分枝杆菌标准株 H37Rv核酸为阳性对照，ddH2O为阴性对照，合成结核分枝杆菌MPT64基因特异性引物。通过PCR技术鉴定30株牛源分枝杆菌临床株MPT64基因序列。结果显示，12株扩增产物均为阳性条带，其它分离株扩增产物为阴性条带，表明30株牛源分枝杆菌中有12株属于结核分枝杆菌复合群(图1B)。结核分枝杆菌复合群在采集自3个地区30株分离株中的占比情况如下：甘肃0株(0/3)，宁夏0株(0/6)，新疆12株(57.1%，12/21)。

进一步采用多位点PCR鉴定法，通过16SrRNA、Rv0577、Rv3349、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120 7个位点鉴定12株MTBC亚型。结果显示，12株MTBC中，9株为牛分枝杆菌，2株为人结核分枝杆菌，1株为牛分枝杆菌BCG(图2)。

注:A为标准株 H37Rv 多位点PCR产物电泳;B为阴性对照多位点PCR产物电泳;C为人结核分枝杆菌多位点PCR产物电泳;D为牛分枝杆菌多位点PCR产物电泳;E为牛分枝杆菌BCG多位点PCR产物电泳;F为非结核分枝杆菌多位点PCR电泳产物;M为2 000 bp DNA Marker;1～7号泳道分别为16S rRNA(543 bp)、Rv3120(404 bp)、Rv0577(786 bp)、IS1561(943 bp)、Rv1510(1 033 bp)、Rvl970(1 116 bp)、Rv3877/8(999 bp)PCR产物。图2 结核分枝杆菌分离株多位点PCR电泳结果Fig.2 Multi-site PCR electrophoresis results of Mycobacterium tuberculosis isolates

表2 30株牛源分枝杆菌MPT64和多位点鉴定结果Tab.2 MPT64 and multiple locus identification of 30 Mycobacterium bovine strains

2.3 MIRU-VNTR PCR结果 采用 Image Lab 软件对 MIRU 4、MIRU 10、Mtub 39、MIRU 40、Mtub04、ETR-C、MIRU16、Mtub21、Mtub30、ETR-B、MIRU24、MIRU 26、ETR-E、QUB26、QUB11b 共 15 个MIRU-VNTR 位点的PCR电泳图谱(图3)进行定量分析(图4B)，得到 12 株MTBC临床株的拷贝数(图4A)。

2.4 MIRU-VNTR聚类结果 使用SPSS统计软件对12株MTBC的15个VNTR位点拷贝数进行聚类分析(图4C)。12株MTBC呈现出10种VNTR基因型，其中8株为单一基因型，即一株菌代表一种基因型，占所有菌株的66.7%；其余4株(33.3%)每2株聚集成一个基因簇，每一基因簇代表一种基因型，共聚集成两个基因簇，菌株成簇率为16.7%。根据聚类图可知，两个基因簇具有较近的亲缘关系，聚类为一个较大的基因群，同一基因簇中的菌株来自于新疆地区的同一牛场，且不同簇来源于不同牛场。

注:M为100 bp DNA Ladder;A为标准株 H37Rv(阳性对照)15个VNTR基因位点多态性:B为结核分枝杆菌在MIRU 24(左1-8)和MIRU 26(右1-8)两个基因位点多态性检测结果;C为结核分枝杆菌在QUB26(1-8)和Mtub21(9-16)两个基因位点多态性检测结果;D为结核分枝杆菌在MIRU 4(左1-8)和Mtub39(右1-8)两个基因位点多态性检测结果;E为结核分枝杆菌在MIRU 10(左1-8)和MIRU 40(右1-8)两个基因位点多态性检测结果;F为结核分枝杆菌在Mtub 30和ETR-B两个基因位点多态性检测结果;G为结核分枝杆菌在ETR-C(左1-8)和MTUB 04(右1-8)两个基因位点多态性检测结果;H为结核分枝杆菌在ETR-E(左1-8)和MIRU 16(右1-8)两个基因位点多态性检测结果;I为结核分枝杆菌在QUB11b(1-8)位点多态性检测结果。图3 MIRU-VNTR 15 位点电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of MIRU-VNTR 15 site

注:A.12株MTBC MIRU-VNTR 15 位点拷贝数;B.Image Lab 软件对 M.b14 号分离株 Mtub 21 位点电泳条带分析结果;C.标准株 H37Rv 和 12 株 MTBC 临床株的系统聚类图(红框内的菌株聚集为一个基因簇)。图4 MIRU-VNTR聚类分析结果Fig.4 Results of MIRU-VNTR cluster analysis

3 讨 论

目前，结核病在世界范围内广泛流行，人兽感染状况居高不下，危害极其严重[15]。MTBC的基因分型鉴定能够追踪其传染源和传播途径，了解感染的优势菌株，鉴别外源性感染或内源性复发，对于地理区域性防控牛结核病具有重要意义。本研究通过结核分枝杆菌多位点鉴定基因PCR鉴定的相关结果提示，新疆地区养殖场中存在结核分枝杆菌，这一结果与相关报道一致。有研究发现，新疆地区8个规模化奶牛养殖场中的乳样和粪便中都分离出结核分枝杆菌[2]，推测可能是携带Mtb的人员流动并传染给奶牛。且MTBC以牛分枝杆菌为主，这一结果与已有报道一致。王岩、林康等的研究发现，养殖场环境来源的MTBC以牛分枝杆菌为主[16-17]，推测牛分枝杆菌存在于感染奶牛的粪便及污染养殖场的土壤、饮水和饲料中，提示奶牛养殖场应做好牛分枝杆菌的防控工作。

对MIRU-VNTR 的 15 个位点的PCR结果进行聚类分析，12 株结核分枝杆菌呈现出 10 种VNTR 基因型。其中 8 株为单一基因型，即一株菌代表一种基因型，这些分离株呈现单独基因型，推测该菌株相互独立，可能不具有地域流行特点；根据聚类图可知，两个基因簇包含 4 株分离株并且具有相似的基因型，推测该基因型是新疆地区奶牛场结核分枝杆菌中主要流行的基因型。

总之，本研究为我国甘肃、新疆和宁夏地区奶牛场牛结核病的防控和促进养牛业健康发展提供一定依据。