IL-25在旋毛虫ES抗原刺激小鼠小肠中的影响

何 灵，那皮沙·居热提，刘祥冉，白 杰

旋毛虫是一种可引起人兽共患病的组织线虫，是最大的细胞内寄生线虫[1]。旋毛虫病的临床症状复杂多样，表现为：恶心、呕吐、发热、腹泻等，病原诊断比较困难。宿主被感染的过程中虫体可产生各类抗原，其中排泄分泌(Excretory-secretory，ES)抗原，直接暴露于宿主免疫系统，是诱导宿主产生免疫应答反应的主要靶抗原[2]。而簇细胞作为一种占比较小的肠上皮细胞，在识别和响应寄生虫感染的过程中起着重要作用[3]。研究表明簇细胞能接收寄生虫感染信号，并释放细胞因子 IL-25 触发 II 型天然免疫反应，最终促进寄生虫驱逐出体内，将不利于寄生虫感染。

本实验通过旋毛虫肌幼虫 ES 抗原作用于健康小鼠小肠，观察IL-25对旋毛虫ES抗原刺激小鼠小肠一些相关细胞因子的表达情况。应用HE染色观察小鼠小肠病理变化，阿尔新蓝-核固红染色观察小鼠小肠杯状细胞表达情况以及用酶联免疫吸附试验检测小肠组织匀浆中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33的含量变化。探究旋毛虫与宿主天然免疫系统相互作用的机制，为临床旋毛虫病的防治和了解旋毛虫对宿主的感染机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 虫种 本研究中所用的旋毛虫从黑龙江省动物源性人兽共患病重点实验室所获得[4]，保种在昆明小鼠体内。

1.2 实验动物 SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠，体重为18～22 g，共30只。均由新疆医科大学动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2016-0003，使用许可证：SYXK(新)2016-0002。

1.3 主要试剂和仪器 小鼠IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33检测试剂盒均购自上海将来实业股份有限公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自索莱宝公司。切片机(德国徕卡公司)，包埋机(常州中威电子仪器有限公司)，组织脱水机(武汉天之瑞医疗科技有限公司)，摊片烤片机(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.4 旋毛虫ES抗原的制备[5]取本实验室保种的旋毛虫小鼠，经口感染400条肌幼虫的昆明小鼠，45 d后剖杀，经人工胃液消化法获得旋毛虫肌幼虫，贝尔曼氏装置收集肌幼虫。收集的虫体用含双抗的灭菌生理盐水清洗 5 次，加入到 1640 培养基中，密度为 5 000条/mL，37 ℃ 5% CO2培养 48 h。收集培养液离心后将上清液装入透析袋中透析，然后用 PEG 20000 浓缩，所得 ES 抗原经 0.22 μm 滤器过滤后应用 SDS-PAGE 进行检测，并测定蛋白含量，保存于-20 ℃备用。

1.5 动物实验分组[6]及取材 30只BALB/c小鼠随机分为3组：空白对照组、旋毛虫排泄-分泌(ES)抗原刺激组与IL-25阻断组。空白对照组小鼠腹腔注射PBS；ES抗原刺激组小鼠腹腔注射旋毛虫ES抗原；IL-25阻断组小鼠腹腔注射抗鼠的IL-25单克隆抗体，3 d后，给予腹腔注射旋毛虫ES抗原，每天1次，连续7 d。各组小鼠于末次注射后禁食12 h(自由饮水)后处死小鼠，沿腹中线切开，暴露小鼠小肠，取小肠清洗，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分冻存于-80 ℃。

1.6 HE染色及阿尔新蓝-核固红染色[7]观察 分离小肠，采集标本，取约2 cm的小肠组织，4%多聚甲醛固定、常规脱水，包埋切片后，分别进行 HE 染色和阿尔新蓝-核固红染色，在显微镜下观察小肠组织变化情况。

1.7 ES抗原对小鼠小肠组织匀浆细胞因子的影响 取小鼠小肠冻存组织1 g左右，用液氮研磨，再低温3 000 r/min、10 min离心，取上清分装冻存于-20 ℃冰箱。按试剂盒要求检测小肠组织中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33含量。

2 结 果

2.1 旋毛虫ES抗原的制备 将收集的肌幼虫在1640 培养基中培养，获取旋毛虫 ES 抗原，所得培养液经透析、浓缩、过滤并测定蛋白含量后，应用SDS-PAGE 检测 ES 抗原的制备和收集情况，结果显示目的蛋白条带主要位于35～53 kD (图1)，表明制备的 ES 抗原质量较好。

注：M为蛋白分子质量标准；1为ES抗原。图1 旋毛虫ES抗原的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of ES antigen

2.2 小鼠小肠组织病理学观察结果 显微镜下观察，对照组小鼠小肠组织结构清晰正常，小肠绒毛无肿胀排列整齐；与空白对照组相比，ES抗原刺激组小肠绒毛出现明显水肿现象，固有层水肿较轻；与空白对照组比较，IL-25阻断组小肠绒毛有轻微的水肿现象，排列较整齐(图2)。

注：A为空白对照组；B为ES抗原刺激组；C为IL-25阻断组。图2 小鼠小肠HE染色(HE，×200)Fig.2 HE staining of mouse small intestine (HE,×200)

2.3 旋毛虫ES抗原刺激小肠杯状细胞的变化 小鼠小肠经阿尔新蓝染色显微镜下观察，与空白对照组相比，ES抗原刺激组中酸性粘液较多，杯状细胞数量增多，且细胞体积变大；与ES抗原刺激组相比，IL-25阻断组中酸性粘液较少，杯状细胞数量减少，且细胞体积相对变小(图3、图4)。

注：A为空白对照组；B为ES抗原刺激组；C为IL-25阻断组。图3 小鼠小肠阿尔新蓝-核固红染色，小肠杯状细胞呈蓝色(×400)Fig.3 Mouse small intestine Alcian blue-nuclear fast red staining;small intestinal goblet cells are blue (×400)

注：A为各组小鼠小肠杯状细胞数量的对比；B为各组小鼠小肠杯状细胞肥大的量化。①与空白对照组比较，P<0.05；②与ES抗原刺激组相比，P<0.05。图4 各组小鼠小肠杯状细胞表达情况Fig.4 Expression of goblet cells in the small intestine in mice in each group

2.4 ES抗原对小鼠小肠组织细胞因子水平的影响 与空白对照组比较，ES抗原刺激组小鼠小肠组织匀浆IL-25(t=4.675，P<0.05)、IL-13(t=5.392，P<0.05)、IL-4(t=4.275，P<0.05)、IL-5(t=4.675，P<0.05)、IL-33(t=4.644，P<0.05)含量升高，差异均有统计学意义。与ES抗原刺激组比较，IL-25阻断组小鼠小肠组织IL-25(t=2.821，P<0.05)、IL-13(t=2.344，P<0.05)、IL-4(t=2.647，P<0.05)、IL-5(t=3.268，P<0.05)、IL-33(t=2.780，P<0.05)含量降低，差异均有统计学意义，见图5和表1。

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与ES抗原刺激组相比，P<0.05。图5 各组小鼠小肠组织细胞因子含量表达情况Fig.5 Expression of cytokines in the small intestine tissue in each group of mice

表1 ES抗原对小鼠小肠组织细胞因子的影响Tab.1 Effects of ES antigen on cytokines in mouse small intestine tissue 单位：pg/mL

3 讨 论

旋毛虫在宿主体内的不同发育时期，均可以通过ES抗原与宿主免疫系统相互作用[8]。由于肌幼虫期是旋毛虫主要的致病时期，并且肌幼虫排泄分泌抗原较易制备，因此本实验选择旋毛虫肌幼虫 ES 抗原来探究IL-25对旋毛虫ES抗原刺激宿主小肠的影响。

2型固有淋巴细胞(group 2 innate lymphoid cell，ILC2s)是一类不表达普通谱系标记物的表面标记物并分泌2型细胞因子(包括IL-4,IL-5和IL-13)的天然淋巴细胞[9]。本实验用酶联免疫吸附实验检测小鼠小肠组织匀浆中的IL-4、IL-5和IL-13，发现与对照组相比，用旋毛虫ES抗原刺激组中IL-4、IL-5和IL-13含量升高，说明在旋毛虫ES抗原刺激小鼠小肠中可能激活了部分ILC2。其实ILC2 作为固有免疫细胞的一员，激活后在肠道免疫中发挥着至关重要的作用，通过表达IL-5来调节其他免疫效应细胞发挥功能，如嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等[10]，还可产生IL-13来刺激杯状细胞分泌粘液，有助于宿主肠道排出寄生虫，防止肠道被寄生虫感染。

ILC2s作为2型淋巴反应的重要参与细胞，其与簇细胞之间的信号通路调节在寄生虫肠道感染中备受关注。例如，Christoph等人发现巴西日圆线虫和螺旋线虫感染后均能触发肠道中II型天然免疫反应：簇细胞被寄生虫信号激活，释放IL-25，作用到ILC2上，使得ILC2细胞数量增加并且释放IL-13，IL-13作用于干细胞，促使其分化成更多的簇细胞和杯状细胞，从而使免疫反应逐级增强，最终达到清除寄生虫的目的[11]。本实验用旋毛虫ES抗原刺激小鼠小肠，发现模型组小鼠小肠中IL-25和IL-13的含量升高，提示旋毛虫ES抗原可能激活簇状细胞上旋毛虫的信号源，从而使其释放IL-25和IL-13。而且，我们用阿尔新蓝-核固红染色观察到经旋毛虫ES抗原刺激的小鼠小肠切片，酸性粘液较多，杯状细胞数量增加，细胞体积变大；当IL-25阻断组的小鼠小肠杯状细胞无明显变化，说明抑制IL-25可能会抑制ILC2，导致IL-25和IL-13的含量相对较低。

IL-33是一种组织来源的核细胞因子，在过敏和蠕虫感染时可促进2型免疫反应。暴露于迁徙的寄生线虫或鼻腔内应用甲壳素(寄生虫表皮的主要物质)，会触发肠道中IL-33的转录或释放[12]。研究表明，缺乏IL-33或IL-33受体ST2的小鼠在松材线虫(Strongyloidesvenezuelensis)、巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)和多形螺旋线虫(Heligmosomoidespolygyrus)中表现出更高的肠道寄生虫负荷，从而确立了IL-33在宿主防御中的中心作用。在任何扰动情况下，ILC2的激活都会响应从环境组织中释放的特定细胞因子，ILC2对细胞因子IL-25和IL-33作出反应[13]。有研究表明IL-33诱导ILC2中的GATA3受体，再表达IL-5和IL-13刺激Th2的相关免疫。本实验研究的旋毛虫ES抗原刺激的小鼠小肠组织中IL-33表达含量较高，说明旋毛虫ES抗原刺激小鼠小肠可能会作用于ILC2中，从而诱导相关细胞因子和酸性粘液增加，使旋毛虫排出宿主肠道组织。本实验中ES抗原刺激组、IL-25阻断组数据显示，IL-25可影响小肠组织中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33含量，提示旋毛虫ES抗原可能激活簇状细胞，从而释放IL-25作用到ILC2细胞，分泌IL-13和酸性粘液及杯状细胞，产生免疫反应达到寄生虫排除宿主体内的目的。

综上，本实验结果证实旋毛虫ES抗原刺激小鼠小肠黏膜可能经IL-25/ILC2途径产生免疫作用，从而促使旋毛虫排出宿主体内。这可能与小肠组织中IL-25、IL-13、IL-4、IL-5及IL-33含量升高和小肠杯状细胞的增加有关。