羧肽酶G2在大鼠体内的组织分布及排泄

吴卓娜，朱鲲鹏，顾若兰，孟志云，甘 慧，朱晓霞，李 俭，窦桂芳

（1.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850；2.中国人民武装警察部队特色医学中心，天津 300162）

羧肽酶 G2（carboxypeptidase G2，CPG2）是用基因重组技术从假单胞菌获得的甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）解毒剂，特异性地作用于MTX游离羧基端的谷氨酸，可快速、持久、大量地将MTX转化为非活性代谢产物，降低大剂量MTX在临床肿瘤治疗中的风险［1-5］。基础研究和临床试验均显示，CPG2迅速降低体内MTX浓度，不通过生物膜转运，对进入肿瘤细胞内的MTX的抗肿瘤活性影响较小，安全性良好。目前，美国FDA已批准其作为MTX的解毒药上市［6-8］。

本研究采用同位素示踪法对国产的CPG2进行［125I］标记（即［125I］CPG2），并对其在大鼠体内的药动学、组织分布和排泄进行研究，为临床研究及临床用药提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

重组CPG2冻干粉针剂（批号：20110803，每支3.50 mg，活性1500 U），重庆科润生物医药研发有限公司；三氯醋酸（trichloroacetic acid，TCA，批号：20110-919，每瓶500 mL），国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白分析测定试剂盒（批号：TC263614，每盒10 mg），美国Thermo公司；［125I］CPG2（每瓶1 mL，放射性1mCi），由北京福瑞生物工程公司标记并纯化。

高效液相色谱仪（LC-20AT），日本岛津公司；γ计数仪（Wallac 1470），美国PerkinElmerTM公司；高效液相色谱仪自动分步收集器（BS-100A），上海沪西分析仪器厂；酶标仪（EIX800），美国Bio-Tek公司；凝胶色谱柱（TSK-GEL G2000，规格：300 mm×7.8 mm，5 μm），日本东芝公司。

1.2 动物

Wistar大鼠36只，雌雄各半，体重180～220 g，购自军事医学研究院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（京）2007-004，实验动物饲养许可证号：SYXK（军）2007-004。动物饲养环境符合实验动物福利伦理委员会要求，大鼠自由饮水摄食，在室温24～26℃、湿度55%～65%、明暗交替12 h（7∶00-19∶00照明）的环境下适应性饲养1周。

1.3 [125l]CPG2的纯度和蛋白含量测定

用高效液相色谱法鉴定［125I］CPG2的纯度，洗脱液为 0.01 mol·L-1磷酸缓冲液，pH 7.4，流速1.0 mL·min-1。用分步收集器收集洗脱液，每0.5 min收集1管，用γ计数仪测定每管的放射性。用BCA试剂盒测定其蛋白含量，96孔板每孔加25 μL系列标准牛血清白蛋白（0.031～2.0 g·L-1）及［125I］CPG2，然后加入200 μL BCA混匀，37℃置30 min，用酶标仪测定其在570 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，加权最小二乘法（1/X2）计算［125I］CPG2的蛋白含量。

1.4 [125l]CPG2在大鼠体内药动学

6只Wistar大鼠，雌雄各半，尾静脉推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1，放射剂量936.88 kBq·kg-1，饲以标准大鼠饲料，自由饮水。给药前及给药后0.08，0.5，1，2，4，14和24 h经眼眶静脉采血，8000×g离心10 min取血清，加入等体积的20%TCA进行酸沉，然后5000×g离心5 min，弃上清，测定酸沉物的放射性。根据血清中酸沉物放射性计算不同时间点的药物浓度，再根据药物浓度-时间曲线，计算[125I]CPG2在大鼠体内的药动学参数。

1.5 [125l]CPG2在大鼠体内组织分布

18只Wistar大鼠，雌雄各半，随机分为3组（0.5，6和24 h组），尾静脉推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1，放射剂量936.88 kBq·kg-1。分别于推注结束后0.5，6和24 h取全血，并将大鼠安乐死，取肝、肾、脾、肺、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、输卵管、输精管、心脏、胰腺、胸腺、小肠、小肠内容物、脂肪、膀胱、胃、胃内容物、大肠、大肠内容物、骨骼、骨骼肌、皮肤、骨髓、脑和眼球，共28种组织或体液、内容物及全血样本。组织和内容物分别称重，剪碎；血液离心，取血清。各处理后的样本加入等重量的20%TCA沉淀蛋白，5000×g离心5 min，弃上清，测定酸沉物的放射性，并计算同一时间点相同组织的平均放射性。

1.6 粪-尿和胆汁排泄实验

Wistar大鼠6只，雌雄各半，尾静脉推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1（放射剂量936.88 kBq·kg-1）后单独饲养于代谢笼内，饲以标准大鼠饲料，自由饮水。给药前和给药后5，8，15，24，41，50，73，102，159，190，211，230和286 h收集尿液和粪便，记录体积或重量，测定其放射性。

Wistar大鼠6只，雌雄各半，麻醉后行胆管插管手术。待大鼠清醒后，尾静脉推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1，放射剂量936.88 kBq·kg-1，给药后5，8，15和24 h收集胆汁，记录体积，测定其放射性。

1.7 统计学分析

使用计算机程序Microsoft Excel和Microcal Origin进行数据处理和制图。采用WinNorlin 5.2的非房室模型计算药动学参数。

2 结果

2.1 [125l]CPG2的纯度和蛋白含量

［125I］CPG2经TSK-GEL G2000凝胶过滤色谱分离后得到一个放射性主峰，该主峰在相同条件下与未标记的CPG2的洗脱保留体积一致，表明洗脱出的放射性主峰为［125I］CPG2，且放射性主峰的放射量占总放射量的95.06%。放射性主峰流分用BCA试剂盒测得蛋白浓度为840 mg·L-1，换算得到比活性为13.87 GBq·g-1，放化纯度为97.8%，满足实验要求。

2.2 [125l]CPG2在大鼠体内的药动学参数

大鼠静脉推注［125I］CPG2 700 μg·kg-1后平均血药浓度-时间变化曲线见图1。药-时曲线下面积AUC 为（27 792±6896）μg·h·L-1，峰浓度Cmax为（16 894±1809）μg·L-1，清除率CL为（0.026±0.005）L·h-1·kg-1，表观分布容积Vd为（0.16±0.04）L·kg-1，半衰期t1/2为（4.2±0.6）h。

2.3 [125l]CPG2在大鼠体内组织分布

大鼠静脉注射［125I］CPG2 700 μg·kg-1后，不同时间点不同组织、内容物及血清的平均放射性见表1。实验结果显示，［125I］CPG2主要分布在血清中，其次为血流丰富的组织及代谢和排泄器官，如肝、肾和胃内容物，在脑、肌肉和脂肪中较低，表明药物不易进入脂肪和肌肉组织，不易透过血脑屏障。给药24 h后［125I］CPG2在泌尿排泄系统内浓度较高，说明其主要通过肾排泄。

Tab.1 Average radioactivity in different tissues，body fluids and contents of digestive tract at different time points after intravenous injection of［125l］CPG2 in rats

2.4 [125l]CPG2在大鼠体内的排泄

大鼠静脉注射［125I］CPG2 700 μg·kg-1后286 h内粪便、尿液和胆汁的平均累积排泄量见表2。给药后286 h内，从尿液中回收到给药量的（84±4）%，从粪便中回收到给药量的（3.00±0.78）%，粪尿合计（87±4）%。给药后24 h内，从胆汁中回收到给药量的（7.77±0.54）%。

Tab.2 Average cumulative excretion of［125l］CPG2 in feces，urine and bile of rats after intravenous injection of［125l］CPG2

3 讨论

本研究应用同位素示踪法探究了［125I］CPG2在大鼠体内的药动学、组织分布和排泄的特点。大鼠尾静脉推注［125I］CPG2后，于不同时间取大鼠组织、内容物及全血，通过γ计数仪测定TCA可沉淀部分的放射性。TCA可沉淀部分是相对分子质量较大的蛋白质，近似代表原形药物CPG2，因此用TCA沉淀部分的放射性统计分析各组织、内容物及血清中CPG2的含量。大鼠尾静脉推注［125I］CPG2后，放射性主要分布在血清中，其次为血流丰富的组织及代谢和排泄的器官，如肝、肾及胃肠道等。［125I］CPG2在脑组织中浓度较低，表明其不易透过血脑屏障；给药后6和24 h，［125I］CPG2在泌尿排泄系统内的浓度较高，推测CPG2可能通过肾排泄。［125I］CPG2在脂肪、肌肉中的放射性含量较低，表明该蛋白不易进入脂肪、肌肉等组织。［125I］CPG2在胃内容物中浓度比较高，可能与标记方法有关。［125I］需要标记到CPG2的酪氨酸上，酪氨酸是碱性氨基酸，胃液为酸性环境，代谢后的125I-酪氨酸或蛋白片断可能通过胃壁分泌，导致在胃肠道内有较高的放射性分布。［125I］CPG2在大鼠体内的排泄研究表明，药物主要从尿液中排泄，少量从粪便中排泄，70%的放射性在给药后24 h内已经排泄，给药后41～286 h的排泄较缓慢，286 h时排泄≥80%。粪便和尿液中的放射性主要是［125I］CPG2的降解产物。

本研究结果可为制定CPG2的临床给药方案提供参考依据，同时也可为其他药物的药动学及组织分布和排泄研究提供借鉴。