尼莫地平/川芎嗪双载药纳米粒的体内药动学和脑组织分布研究

何雯洁++洪倩　梁静　何晓玮　朱逢佳

[摘要] 制备尼莫地平/川芎嗪双载药纳米粒（NMD/TMPNPs），考察其体内药动学行为和脑组织分布情况，探讨双载药纳米粒用于提高药物疗效的可能性。该试验采用复乳法制备NMD/TMPNPs，超速离心法测其包封率和载药量，透析法测其体外释放，并以NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs混悬液、（NMDNPs+TMP）混悬液为对照组，考察大鼠尾静脉注射NMD/TMPNPs混悬液后NMD的体内药动学行为和脑内分布情况。所制备纳米粒中NMD的包封率和载药量分别为（79.71±0.73）%， （1.74±0.02）%，TMP的包封率和载药量为（40.26±1.51）%， （4.38±0.16）%；制成纳米粒后，其体外释放具有缓释特点。体内药动学和组织分布主要参数：NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs混悬液、（NMDNPs+TMP）混悬液、NMD/TMPNPs混悬液t1/2β分别为（1.097±0.146），（1.055±0.06），（1.950±0.140），（1.860±0.096），（2.497±0.475） h，CL分别为（0.778±0.098），（1.133±0.111），（0.247±0.023），（0.497±0.040），（0.297±0.024） h·L-1，AUC0∞分别为（514.218±60.383），（352.916±33.691），（1 618.429±240.198），（804.110±75.804），（1 349.058±215.497） μg·h·L-1；各组脑内AUC0t分别为0.301 9，0.624 8，1.068 6，1.313 0，1.046 5 mg·h·L-1。结果表明NPs延缓了NMD在体内的消除，加入TMP或制备为双载药纳米粒均可明显改善NMD体内药动学行为，并显著提高NMD脑内含量。

[关键词] 川芎嗪； 尼莫地平； 双载药纳米粒； 药动学； 脑内分布

Pharmacokinetics and brain distribution of NMD/TMPnanoparticles

HE Wenjie1， HONG Qian1， LIANG Jing1， HE Xiaowei2， ZHU Fengjia1*

（1. Zhejiang Hospital， Hangzhou 310012， China；

2. The First Hospital Affiliated to Huzhou Teachers′ University， Huzhou 313000， China）

[Abstract] This study aims to prepare nimodipine/tetramethylpyrazineloaded poly（D， Llactidecoglycolide） dualdrug nanoparticles （NMD/TMPNPs） and investigate pharmacokinetics and brain distribution to evaluate the possibility of enhancing the drug effect of dualdrug nanoparticles. NMD/TMPNPs were prepared via W/O/W emulsion solvent evaporation. Entrapment efficiency and drug loading of NMD/TMPNPs were investigated by ultracentrifugation， and drug release behavior in vitro was studied by dialysis method. The pharmacokinetic and brain distribution were studied in SD mice administered intravenously with NMD/TMPNPs in comparison with NMDsuspension， NMD/TMPsuspension and NMDNPs， （NMDNPs+TMP）suspension. According to the results， the entrapment efficiency and drug loading of NMD were （79.71±0.73）%， （1.74±0.02）%， those of TMP were （40.26±1.51）% and （4.38±0.16）%. The nanoparticles showed the property of sustained release. On the basis of the major parameters for in vivo pharmacokinetic and brain distribution， t1/2β of NMDsuspension， NMD/TMPsuspension and NMDNPs， （NMDNPs+TMP）suspension， NMD/TMPNPs were （1.097±0.146）， （1.055±0.06）， （1.950±0.140）， （1.860±0.096）， （2.497±0.475） h， CL were （0.778±0.098）， （1.133±0.111）， （0.247±0.023）， （0.497±0.040）， （0.297±0.024） h·L-1， AUC0t in rat plasma were （514.218±60.383）， （352.916±33.691）， （1 618.429±240.198）， （804.110±75.804）， （1 349.058±215.497） μg·h·L-1， respectively， and AUC0t in brain were 0.301 9， 0.624 8， 1.068 6， 1.313 0， 1.046 5 mg·h·L-1， respectively. According to the in vivo study， the pharmacokinetic behavior of NMD were markedly prolonged by adding TMP or prepared dualdrug nanoparticles.

[Key words] nimodipine； tetramethylpyrazine； dualdrug nanoparticle； pharmacokinetics； brain distribution

doi：10.4268/cjcmm20162227

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）为一类具有多药耐药逆转（multidrug resistance，MDR）调节功能的吡嗪类生物碱，具有疏通血脉、促进血行、消散淤血的功效，临床上多用于扩张脑血管、抑制血小管平滑肌痉挛等。文献表明川芎嗪具有限制Pglycoprotein（Pgp）底物外排的作用[1]，可通过抑制Pgp的ATP酶活性来抑制Pgp的功能[23]。尼莫地平（nimodipine，NMD）为一类二氢吡啶类钙离子拮抗剂，临床上多用于治疗脑血管疾病[4]，但其作为Pgp的底物，易受血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）上Pgp外排作用影响，致使其脑内浓度较低[5]。因此将TMP与NMD合用，有望提高NMD脑内浓度，但NMD和TMP简单合用，一方面由于TMP血浆清除率较高[6]且易被脑组织清除[7]，限制了其抑制Pgp功能的作用；另一方面，短时间内TMP浓度过高易导致脑内NMD浓度过高，对正常细胞或组织产生毒性[8]，故本试验拟制备川芎嗪/尼莫地平双载药纳米粒合用两药，并考察川芎嗪对尼莫地平体内过程的影响。

1 材料

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； Labconco冷冻干燥机（美国Labconco公司）；TGL16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；VORTEX5型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；减压干燥器（上海精宏实验设备有限公司）。

聚乙二醇（聚乳酸羟基乙酸）（济南岱罡生物工程有限公司，相对分子质量18 000）；尼莫地平对照品（中国食品药品检定研究院，批号10027020002）；尼莫地平原料药（湖北恒硕药业有限公司，纯度98%，批号20130625）；盐酸川芎嗪对照品（中国食品药品检定研究院，批号110817201006）；盐酸川芎嗪原药（南通飞宇生物有限公司，纯度98%，批号FY17610610）；甲醇（美国Honeywell Burdick&Jackson公司）；肝素钠（中国江苏常州千红生化制药股份有限公司，批号110921）；水合氯醛（上海强顺化学试剂有限公司，批号20090401）；生理盐水（石家庄鹏海制药有限公司，批号1208122040）；乙腈（天津市四友精细化学品有限公司，批号30333203514）；乙醚（中国杭州化学试剂有限公司，批号20100421）；正己烷（上海凌峰化学试剂有限公司，批号20131023）；其他试剂均为分析纯。

清洁级SD大鼠（220±10） g，浙江中医药大学实验动物中心提供，动物使用编号SCXK（浙20080036）。所有动物试验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行。

2 方法与结果

2.1 尼莫地平/川芎嗪双载药纳米粒的制备

2.1.1 双载药纳米粒的制备方法 称取1 mg NMD和40 mg mPEGPLGA溶于乙酸乙酯中构成有机相，称取5 mg TMP溶于水中构成内水相，称取适量PVA溶于水中构成外水相（调节pH为9.0），称取适量PVA溶于水中构成分散相。将内水相加入到有机相中超声获得初乳，将初乳迅速加入至外水相中超声获得复乳，将复乳滴加到分散相中搅拌即得到NMD/TMPNPs。

2.1.2 双载药纳米粒的质量评价 经2.1.1工艺制备的NMD/TMPNPs外观呈类圆形，表面光滑，粒径小（176 nm左右），粒径分布窄（PDI<0.1），NMD的包封率为（79.71±0.73）%，载药量为（1.74±0.02）%，TMP包封率为（48.26±1.13）%，载药量为（5.24±0.12）%。

2.1.3 双载药纳米粒的体外释放考察 本试验采取透析法考察其体外释放特性。NMD/TMPNPs体外释放过程中NMD和TMP均符合Weibull方程，分别为Q=0.504t-1.898 4（R2=0.987 6）和Q=0.513 5t-1.608 9（R2=0.988 4）。其体外释放曲线见图1。

2.2 体内尼莫地平的含量测定

2.2.1 色谱条件 Thermo Hypersil Gold C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇水（62∶38），流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长238nm；进样体积20 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取适量NMD，TMP于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得NMD/TMP对照品溶液。

2.2.3 血浆样品处理方法 精密移取血浆样品200 μL置2 mL具塞离心管中，加入乙腈800 μL，涡旋混合3 min，1万 r·min-1离心10 min，取上清液于40 ℃用氮气流吹干，残渣用200 μL甲醇溶解，充分涡旋振荡后1万 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。

2.2.4 脑组织样品处理方法 将脑组织按1∶4加入生理盐水，高速匀浆器8 000 r·min-1匀浆10 min，取匀浆100 μL于2 mL离心管中，加入乙醚正己烷（1∶1）1.5 mL，涡旋5 min，超声10 min后，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液于2 mL离心管中用氮气流吹干，残渣用200 μL甲醇溶解，充分涡旋后1万 r·min-1离心10 min，取上清液20 μL进样分析。

2.2.5 血浆内NMD含量测定方法 标准曲线：精密称取减压干燥至恒重的NMD对照品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度为1 427 mg·L-1的对照品溶液，临用前稀释至系列浓度。精密吸取空白血浆1 mL 7份，分别加入系列浓度的对照品溶液20 μL，涡旋混合，得质量浓度分别为0.356 7，0.713 5，1.783 7，3.567 5，7.135 0，17.837，35.675，71.350，142.70 mg·L-1的NMD系列血浆对照溶液，按2.2.3项下方法处理后进样测定，以峰面积（A）对血浆中NMD的浓度（C）进行线性回归，建立标准曲线方程。计算得血浆中NMD的标准曲线方程为A=73.823C-23.23（r=0.999 3），表明NMD血浆质量浓度在0.356 7～142.70 mg·L-1线性关系关系良好。

精密度：取低、中、高3个浓度供试品溶液进样测定，分别在日内测定5次，连续测定5 d（每天1次），计算日内和日间精密度。其日内精密度分别为4.7%，2.4%，2.9%，日间精密度分别为3.7%，2.9%，2.8%。

提取回收率：精密量取含NMD低、中、高3个浓度的NMD/TMP溶液，加入200 μL空白血浆中，涡旋2 min，混匀，配成质量浓度为50.00，100.00，200.00 μg·L-1的血浆样品，按2.2.3项下方法处理后进样分析；另配制含NMD低、中、高3个相同浓度的NMD/TMP对照品溶液，不加空白血浆，直接挥干进样测定，计算血浆样品经处理后的峰面积与对照溶液峰面积的比值，每个浓度平行测定3次。其提取回收率为（69.33±5.24）%，（72.88±6.99）%，（72.53±2.03）%。

2.2.6 脑组织内NMD含量测定方法 脑组织标准曲线：精密称取减压干燥至恒重的NMD对照品适量，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度为15.00 mg·L-1的对照品溶液，临用前稀释至系列浓度。精密吸取空白组织匀浆100 μL 8份，分别加入系列浓度的对照品溶液20 μL，涡旋混合，得质量浓度分别为0.01，0.03，0.06，0.15，0.60，1.50，3.00，6.00 mg·L-1的NMD系列组织匀浆对照溶液，按2.2.4项下方法处理后进样测定，以峰面积（A）对组织中NMD的浓度（C）进行线性回归，建立标准曲线方程。计算得组织匀浆中NMD的标准曲线方程为A=110.32C+4.351 2（r=0.999 8），表明NMD组织匀浆质量浓度在0.01～6.00 mg·L-1线性关系良好。

精密度考察：取低、中、高3个浓度供试品溶液进样测定，分别在日内测定5次，连续测定5 d（每天1次），计算日内和日间精密度。其日内精密度分别为6.9%，4.2%，4.0%，日间精密度分别为4.0%，3.2%，3.1%。

提取回收率考察：精密量取含NMD低、中、高3个浓度的NMD/TMP溶液，加入200 μL空白脑组织中，涡旋2 min，混匀，配成质量浓度为0.01，0.15，1.50 mg·L-1的血浆样品，按2.2.4项下方法处理后进样分析；另配制含NMD低、中、高3个相同浓度的NMD/TMP对照品溶液，不加空白血浆，直接挥干进样测定，计算血浆样品经处理后的峰面积与对照溶液峰面积的比值，每个浓度平行测定3次。其提取回收率为（72.38±6.04）%，（76.97±4.54）%，（78.26±2.66）%。

2.3 体内药动学研究

称取适量NMD和NMD/TMP原药粉末于10 mL量瓶中，用适量乙醇超声溶解，用0.9%生理盐水稀释至刻度，得NMD混悬液和NMD/TMP混悬液。称取适量NMDNPs和NMD/TMPNPs冻干粉于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，得NMDNPs和NMD/TMPNPs混悬液。称取适量NMDNPs和TMP原药粉末于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，得（NMDNPs+TMP）混悬液。

取健康SD大鼠30只，禁食12 h，自由饮水，随机分为5组，每组6只。按NMD 2 mg·kg-1单剂量尾静脉注射分别给予NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs混悬液、NMD/TMPNPs混悬液和（NMDNPs+TMP）混悬液，给药后分别于5，15，30，60，120，240，360，480，600，720 min经股动脉取血0.5 mL，置肝素钠预处理的2 mL具塞离心管中， 6 000 r·min-1离心5 min，分离血浆后，置-80 ℃低温冰箱保存待测。每次取血后立即用注射器给予等量的0.9%生理盐水。

大鼠尾静脉注射NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs混悬液、NMD/TMPNPs混悬液和（NMDNPs+TMP）混悬液后，平均血药浓度时间曲线见图2。数据经拟合后符合开放式二室模型，所得主要药动学参数见表1，并对其进行统计学分析。

2.4 脑组织分布研究

称取适量NMD原料药于10 mL量瓶中，用适量乙醇超声溶解后，加入0.9%生理盐水稀释至刻度，得NMD混悬液。称取适量NMD原料药和TMP原料药于10 mL量瓶中，用适量乙醇超声溶解后，加入0.9%生理盐水稀释至刻度，得NMD/TMP混悬液。称取适量NMDNPs和NMD/TMPNPs冻干粉于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，分别得NMDNPs混悬液和NMD/TMPNPs混悬液。称取适量NMDNPs冻干粉和TMP原料药溶于10 mL量瓶中，用适量0.9%生理盐水超声溶解并稀释至刻度，得（NMDNPs+TMP）混悬液。

取健康SD大鼠60只，禁食12 h，自由饮水，随机分为5组，每组12只，按NMD 2 mg·kg-1单剂量尾静脉注射分别给予NMD混悬液、NMD/TMP混悬液、NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMD/TMPNPs+TMP），给药后分别于0.25，2，4，6 h（每个时间点平行3只大鼠）颈椎脱臼处死，迅速取出脑组织用生理盐水冲洗，然后用滤纸吸干，置-80 ℃低温冰箱保存待测。

大鼠尾静脉注射NMD混悬液，NMD/TMP混悬液，NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMDNPs+TMP）后，按上述方法操作，并按2.2.6项下方法处理样品后进样分析。结果见图3，NMD混悬液，NMD/TMP混悬液，NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMDNPs+TMP）中脑内AUC0t分别为0.301 9，0.624 8，1.068 6，1.313 0，1.046 5 mg·h·L-1。

由图3可知，给药0.25 h时，NMD/TMPNPs组在脑内药物浓度达到最大值（0.713 2±0.070 3） mg·L-1；给药4 h时，（NMDNPs+TMP）组在脑内药物浓度达到最大值（0.343 4±0.148 2） mg·L-1；给药6 h时，NMDNPs组在脑内药物浓度达到最大值（0.345 2±0.025 9）mg·L-1；给药4 h时，在试验条件下NMD组和NMD/TMP组在脑内均未检测到药物。

3 讨论

药动学研究结果显示：与单用NMD组相比，两药联用组t1/2α显著降低（P<0.01），这与其他药物和Pgp抑制剂联用研究结果相符[9]，t1/2α降低提示TMP可能在一定程度上促进了NMD向组织的分布[10]，降低了药物在血浆内滞留时间，有效发挥了Pgp抑制剂的作用；而制备成双载药纳米粒后，TMP依然能够改善NMD的体内药动学行为，说明NPs并未明显影响TMP对NMD体内分布的促进作用，同时避免了药物半衰期短的缺点。

组织分布研究结果显示：与单药组比较，双药组入脑速度均更快，AUC0t均显著提高（P<0.01），说明TMP具有促进NMD入脑的作用，其原因一则可能是TMP抑制了Pgp 的ATP酶活性，二则可能是TMP提前释放，并作为Pgp抑制剂与Pgp结合并使其饱和，2种原因作用下Pgp功能受到抑制，使得NMD更易入脑[1112]；与原药组比较，纳米粒组均能缓慢分布于脑组织且滞留时间更长，提示NPs具有一定的缓释作用，并且双载药不影响该特性；与NMD组和NMDNPs组比较，NMD/TMPNPs组显著提高了NMD在脑内的浓度，说明双载药纳米粒在实现同时包载药物和Pgp抑制剂的同时，并未丧失NPs缓释高效的优势。

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[责任编辑 曹阳阳]