基于膜电位检测原理的 γ-氨基丁酸A型受体药物高通量筛选模型

张 毅，石 童，张瑞华，陈学军，靳 倩，石晶晶，王 陈，李丽琴

（国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205）

γ-氨基丁酸A型受体（γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR）是由5种亚基组成的配体门控氯离子通道受体，其中α1β2γ2亚型组成在人体内分布最广［1］。GABAAR因为其多样的药理学功能被广泛关注，激动剂GABA通过抑制兴奋发生和传递，介导镇静睡眠、抗惊厥和抗焦虑等相关生理过程［2-3］，阳性变构剂地西泮（diazepam，Dia）通过对GABAAR的变构作用增强GABA对GABAAR的激动作用［4-5］。因此，GABAAR作为抗焦虑和镇静睡眠药物作用的主要靶点，在睡眠发生和维持等睡眠相关过程中发挥重要功能。

体外基于GABAAR的促睡眠药物筛选方法主要有标记法和非标记法，其中非标记法主要有膜片钳电生理检测法、Cl-敏感荧光染料检测法和膜电位检测法。膜片钳电生理检测法存在对细胞有损伤作用、检测通量小、成本高昂的问题；Cl-敏感荧光染料检测法存在易漂白、检测时限短的问题［6］。近年来发展的基于膜电位检测原理的实时荧光信号检测技术，其检测原理为：当激动剂GABA作用于GABAAR时，引起Cl-内流进入细胞膜，膜内侧呈负电性，细胞表现为超极化状态，这种超极化状态很快被细胞外的阳离子进入膜内侧而削弱。本研究中使用的膜电位敏感荧光染料具有阳离子亲和性，在阳离子进入膜内侧的同时，荧光染料也随阳离子一起进入细胞膜内，表现为荧光信号增强，荧光信号的大小与激动剂GABA剂量相关。因此，激动剂GABA引起的Cl-内流表现为较高的荧光信号，反之，表现为较低的荧光信号。该技术已经在Na+和K+通道药物筛选中获得应用［7-8］，但是在Cl-通道药物筛选中尚未得到广泛应用。随着荧光信号检测仪器灵敏度和检测通量的提高，基于膜电位检测原理的高通量药物筛选方法显示出良好的应用前景。

本研究拟应用表达人源α1β2γ2L亚型的GABAAR-CHO细胞株建立基于膜电位检测原理的药物高通量筛选方法，并通过方法优化、工具化合物精密度检测、工具化合物剂量-效应关系检测等进行方法考察，为靶向GABAAR的活性化合物的早期发现提供了良好的技术基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

表达人源α1β2γ2L亚型的GABAAR-CHO细胞株（α1亚基诱导表达，由本课题组构建并保存）；红色染料、蓝色染料和Tetra型实时荧光定量分析系统（美国Molecular Devices公司）；GABA（批号：APN15178-1-1，英国Abcam公司）；Dia（批号：171225-200903，中国药品生物制品检定研究所）；加巴嗪（gabazine，Gab，批号：G215SM0150，美国Alomone公司）；DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；Hank′s液（上海吉至生化有限公司）；384孔细胞检测板和384孔化合物板（德国Greiner公司）；其他试剂均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品。Countstar BioTech型细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；B3111型CO2培养箱和1384型超净工作台（美国Thermo公司）；IX51型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Five Easy型pH检测仪（瑞士Mettler Toledo公司）；万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 GABAAR药物高通量筛选反应体系构建

将细胞在DMEM/F12混合培养基中常规培养，培养基中加入10%胎牛血清、杀稻瘟菌素10 mg·L-1、选择性抗生素博来霉素100 mg·L-1、嘌罗霉素1 mg·L-1和潮霉素B 300 mg·L-1。将细胞置于37℃含5% CO2细胞培养箱中常规培养，每2 d按照1∶8～1∶10的比例传代。

基于膜电位检测原理构建药物高通量筛选方法的反应体系，该反应体系包含贴壁完全的细胞、膜电位敏感染料、激动剂激活受体浓度和反应缓冲液。首先，当细胞生长密度达到80%时，在GABAAR-CHO细胞中加入四环素1 mg·L-1诱导α1亚基表达36 h，在诱导表达12 h后消化细胞，将诱导表达的GABAAR-CHO细胞按照每孔1×104个细胞接种到384孔板，继续诱导表达24 h后制备成384孔细胞板（检测前去掉培养基），然后加入20 μL红色染料孵育30 min；另外，采用含Cl-的缓冲液制备含有0.15 μmol·L-1激动剂 GABA（包含阳性变构剂或拮抗剂的GABA溶液）每孔体积为40 μL的化合物板，设置化合物加样体积为5 μL；最后将染料孵育过的384孔细胞板和384孔化合物板放入膜电位实时荧光检测分析系统进行荧光信号检测，设置仪器参数为：检测时间130 s，每秒1次，前10 s进行基线检测（获得荧光信号B0），第11～130秒进行化合物检测（获得荧光信号B1）。Tetra型实时荧光定量分析系统检测GABAAR-CHO细胞膜电位信号的仪器参数设置详见表1。在以下的方法优化中主要对缓冲液体系、激动剂GABA浓度、染料类型和染料孵育时间进行优化选择。

Tab.1 lnstrument parameters of FLlPRTETRAfor detection of γ-aminobutyric acid type A receptor（GABAAR）-CHO membrane potential signals

1.3 GABAAR药物高通量筛选方法优化

1.3.1 缓冲液体系选择

缓冲液体系采用两因素交叉设计实验方法，因素1为缓冲液类型，分别为含Cl-缓冲液和无Cl-缓冲液，因素2为加入体系中的化合物体积，分别为5，10，20和25 μL。

含Cl-缓冲液配方为（mmol·L-1）：CaCl21.26，MgCl20.82，KCl 5.33，NaCl 137.93，KH2PO40.44，Na2HPO40.34，葡萄糖 5.56，HEPES 20，用1 mmol·L-1的NaOH溶液将pH调节至7.4；无Cl-缓冲液配方为（mmol·L-1）：葡萄糖酸钙 1.26，葡萄糖酸镁 0.82，葡萄糖酸钾 5.33，葡萄糖酸钠137.93，KH2PO40.44，Na2HPO40.34，葡萄糖 5.56，HEPES 20，用1 mmol·L-1的NaOH溶液将pH调节至7.4。

以GABA 1.00 μmol·L-1和GABA 0.15 μmol·L-1+Dia 30 μmol·L-1的检测信号曲线获得的激活值（activation signal value，ASV）（首先将第60～80秒的荧光信号B1对前10 s基线检测B0归一化处理，扣除本底后的数据的平均值）和Z′因子作为判定指标，判定缓冲液类型与化合物加样体积对GABAAR膜电位高通量筛选方法的影响。Z′=1-3×（s样本信号+s本底信号）/|xˉ样本信号-xˉ本底信号|。

1.3.2 检测体系中激动剂GABA浓度选择

分别在10%激动效应浓度（excitatory concentration of 10%，EC10），EC20和EC50GABA浓度（即0.05，0.10 和 0.25 μmol·L-1）条件下，对 Dia 的12个浓度梯度浓度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）进行荧光信号检测，将第11～130秒的荧光信号B1对前10 s基线检测B0作归一化处理，扣除本底后获得检测信号曲线，计算该曲线下面积（area under curve，AUC）。以化合物浓度的常用对数值为横坐标，以相对活性百分率（relative activity percentage，RAP，以工具化合物的最大激动或抑制信号曲线的AUC值作为100%，对各浓度下的AUC值进行百分比计算则为该浓度的RAP）为纵坐标，采用Origin 2019软件进行logistic曲线拟合，获得不同GABA浓度下，阳性变构剂Dia的EC50值，以该值作为判定指标，将测得Dia EC50值较低（灵敏度较高）的GABA的浓度作为GABA激活受体的浓度。

1.3.3 染料选择

分别采用红色和蓝色染料孵育细胞，对激动剂GABA 的 11个浓度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10和30 μmol·L-1）和阳性变构剂Dia的12个浓度梯度（0.0005、0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）进行荧光信号检测，并按1.3.2方法对荧光信号的AUC和RAP进行计算，以化合物浓度的对数值为横坐标，以各浓度的RAP为纵坐标，对GABA和Dia的EC50进行检测。以GABA和Dia的活性EC50值以及在2个化合物EC80浓度下获得的ASV和Z′因子作为判定指标，判定染料的适用性。

1.3.4 染料孵育时间

分别在细胞与染料孵育10，30，50和120 min条件下，其余步骤同1.3.3，判定染料孵育的最佳时间。

1.4 GABAAR药物高通量筛选方法稳定性

采用优化方法分别对不同浓度的激动剂GABA（0.05，0.25和1.00 μmol·L-1）、阳性变构剂Dia（1，5和30 μmol·L-1）和拮抗剂 Gab（0.1，1.0和10.0 μmol·L-1）进行批间精密度考察，各浓度设6个复孔，连续检测3 d。通过对3个化合物在不同浓度下荧光信号的AUC进行统计分析，计算获得批间变异系数（coefficient of variation，CV%），以评价方法的精密度；计算工具化合物各浓度下的Z′因子，判定方法测定数据的质量，以评估方法的稳定性。

1.5 GABAAR药物高通量筛选方法灵敏度

采用优化的检测条件对工具化合物激动剂GABA 的 11个浓度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10和30 μmol·L-1），阳性变构剂Dia的11个浓度梯度（0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30 和90 μmol·L-1）和拮抗剂Gab的12个浓度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）进行荧光信号检测，并对荧光信号的AUC进行计算分析。各浓度均设4个复孔。以化合物浓度的常用对数值为横坐标，以各浓度的RAP为纵坐标，采用Origin 2019软件进行logistic曲线拟合，获得化合物的EC50或50%抑制效应浓度（inhibitory concentration，IC50），以评价方法的检测灵敏度。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 GABAAR药物高通量筛选反应体系构建

荧光信号检测结果（图1）显示，GABAAR-CHO细胞上，GABA 0.15 μmol·L-1对在诱导表达 α1亚基的GABAAR-CHO细胞有明显的激动作用；在Dia 30 μmol·L-1存在下，GABA 0.15 μmol·L-1对细胞的激活作用进一步增强（图1A）；在Gab 10.0 μmol·L-1存在下，GABA 0.15 μmol·L-1对细胞的激活作用被削弱（图1B）；单独应用阳性变构剂Dia 30 μmol·L-1或含Cl-缓冲液均对细胞无明显激活作用。

2.2 GABAAR药物高通量筛选方法优化

2.2.1 不同缓冲液体系对筛选检测指标的影响

实验通过含Cl-缓冲液和无Cl-缓冲液与5，10，20和25μL加样体积交叉设计，对GABA 1.00μmol·L-1和 GABA 0.15 μmol·L-1+Dia 30 μmol·L-1的 ASV 和Z′因子计算结果见图2。在检测GABA信号时，在不同的加样体积下，各含Cl-组和无Cl-组的ASV值和Z′因子之间均无显著差异（图2A和2C）。在检测阳性变构剂Dia信号时，在不同的加样体积下，各含Cl-组ASV值均明显高于无Cl-组（P＜0.05）（图2B），含Cl-组Z′因子均大于无Cl-组（图2D），随着加样体积的增加，2组ASV和Z′因子均减小，其中ASV在加样体积10，20和25 μL时较加样体积5 μL时显著减少（P＜0.05）（图2B）。

2.2.2 不同激动剂浓度对变构剂检测的影响

分别在GABA终浓度0.05，0.10和0.25 μmol·L-1下，对不同Dia浓度下AUC值进行检测，结果（表2）显示，在不同GABA浓度下，阳性变构剂Dia的EC50值随激动剂GABA浓度增大而逐渐减小。与GABA EC10浓度下Dia检测结果相比，在GABA EC20和GABA EC50浓度下，Dia的 EC50检测值更低（P＜0.05），检测更灵敏。

Tab.2 Effect of GABA activation concentration on excitatory concentration of 50%（EC50）of allosteric activity Dia

2.2.3 不同染料对筛选检测指标的影响

采用红色或蓝色染料孵育细胞时，分别检测激动剂GABA、阳性变构剂Dia的活性，其EC50、ASV和Z′因子见图3和表3。不同染料孵育下，激动剂GABA检测的EC50值、ASV、Z′因子的检测结果无显著性差异，变构剂Dia的ASV大小无明显差异；在对变构剂Dia的EC50检测时，蓝色染料比红色染料的EC50增大约2.73倍（P＜0.05）；红色染料Z′因子（0.59）显著高于蓝色染料Z′因子（0.40）（表3）。表明使用GABAAR-CHO细胞对阳性变构剂Dia引起的膜电位检测时，红色染料检测灵敏度比蓝色染料更高。

Tab.3 Effect of dye on concentration-effect relationships of GABA and Dia

2.2.4 不同染料孵育时间对筛选检测指标的影响

分别将细胞与染料孵育10，30，50和120 min，检测激动剂GABA和阳性变构剂Dia的活性，其EC50值、ASV、Z′因子的检测结果（图4，表4）显示，在染料孵育30和50 min条件下，GABA和Dia的EC50值较染料孵育10和120 min条件下更低（P＜0.05），检测灵敏度更高；在染料孵育30和50 min条件下，GABA和Dia的Z′因子较染料孵育10和120 min条件下更高，检测稳定性更好。表明染料孵育时间控制在30～50 min更适于对GABAAR活性化合物的检测。

Tab.4 Effect of dye on concentration-effect relationships of GABA and Dia

2.3 GABAAR药物高通量筛选方法的稳定性

如表5所示，使用优化后膜电位检测方法，对GABA（0.05，0.25 和 1.00 μmol·L-1）、Dia（1，5 和30 μmol·L-1）和 Gab（0.1，1.0 和 10.0 μmol·L-1）的荧光信号AUC值进行批间变异系数CV%和Z′因子的计算，3个化合物在不同浓度下CV%均≤15.64%，其中，在GABA 0.25 和1.00 μmol·L-1、Dia 5和 30 μmol·L-1及 Gab 10.0 μmol·L-1条件下测得的CV%均≤10%。在GABA 0.25和1.00 μmol·L-1、Dia 5和30 μmol·L-1和Gab 1.0和10.0 μmol·L-1条件下测得的Z′因子均≥0.4。结果表明，优化后GABAAR药物高通量筛选方法可用于GABAAR相关化合物的活性检测，该方法稳定性较高。

Tab.5 Stability of high throughput screening method for GABA，Dia and Gab

2.4 GABAAR药物高通量筛选方法的灵敏度

采用优化后的GABAAR药物高通量筛选方法对激动剂GABA、阳性变构剂Dia和拮抗剂Gab的剂量-效应关系进行检测，结果见图5。获得GABA的EC50值为（137.4±26.3）nmol·L-1，Dia的EC50值为（3.2±0.7）μmol·L-1，Gab的 IC50值为（164.9±36.6）nmol·L-1。

3 讨论

GABAAR作为Cl-通道受体，与抗焦虑、镇静、睡眠等生理活动密切相关。高通量筛选作为药物发现最有效的技术手段之一，已广泛应用于靶向药物筛选［9］。为了开发新型抗焦虑、镇静、促睡眠药物，本研究利用电压敏感染料可以电压依赖方式在细胞内外质膜间转移从而产生荧光信号变化的原理［10-11］，在GABAAR-CHO细胞株上构建了GABAAR药物高通量筛选方法，该方法实现了对激动剂、阳性变构剂、拮抗剂等靶向GABAAR的不同性质化合物药理学作用的检测，检测特异性好。

在方法优化中，以EC50值、ASV和Z′因子为评价指标，对缓冲液体系、激动剂GABA激活浓度、染料种类以及染料孵育时间等条件进行了优化选择。其中，在高通量筛选中，需要使用阳性化合物来评估筛选条件和测量方法的质量，从而预测高通量筛选方法的可行性，Z′因子作为度量标准，是一个无量纲的参数，该参数不仅用于评估测定数据的质量，还用于评价阳性对照与本底信号之间的分离度以及阳性对照信号动态变化范围。在各种浓度下均可计算Z′因子。多数文献采用EC80浓度下计算Z′因子，优化后的高通量方法在该浓度下的Z′因子≥0.4，通常认为高通量检测方法是可行的，该方法中阳性和阴性对照的分离度较好，可用于高通量筛选［10］。本研究以激动剂GABA和阳性变构剂Dia为模型化合物，选择EC50值较低，ASV较高，Z′因子较大的条件作为优化后条件，分别获得优化后的条件为，使用含GABA EC20～EC50浓度的5 μL含Cl-加样体积，对使用红色染料孵育30～50 min的GABAAR-CHO细胞进行工具化合物的检测，Z′因子均≥0.4，符合高通量检测要求。

方法稳定性考察表明，对不同浓度的激动剂GABA、阳性变构剂Dia和拮抗剂Gab进行检测的CV%分别介于4.09%～15.30%、5.59%～8.30%和5.65%～15.64%；对3个工具化合物在高浓度（GABA 1 μmol·L-1，Dia 30 μmol·L-1和 Gab 10 μmol·L-1）下测得的Z′因子分别为0.861，0.558和0.817，在中浓度（GABA 0.25 μmol· L-1，Dia 5 μmol· L-1，Gab 1 μmol·L-1）下测得的 Z′因子分别为 0.822，0.400和0.712。表明本方法优化后检测精密度较好，检测数据质量较高，符合高通量筛选方法对数据的可重复性和稳定性的要求。

本研究采用优化后的方法对工具化合物剂量-效应关系进行检测，以评价本方法可靠性。实验结果显示，采用本方法测得激动剂GABA的EC50值为（137.4±26.3）nmol·L-1。文献报道，采用膜电位检测方法在表达GABAAR的HEK293细胞上对GABA检测的 EC50值为 2.2～4.7 μmol·L-1［11-12］，本方法灵敏度较文献方法高16～34倍；文献报道，采用电生理方法在表达GABAAR的爪蟾卵母细胞上对GABA 检测的 EC50值为 7.3～51.2 μmol·L-1［13-15］，本方法较电生理检测方法灵敏度高＞53倍。采用本方法检测得阳性变构剂Dia的EC50值为（3.2±0.7）μmol·L-1。文献报道，采用膜电位检测方法在表达GABAAR的HEK293细胞上检测到Dia的EC50值为 10.0 μmol·L-1，本方法灵敏度比该文献方法提高约3倍［14-15］；文献用电生理方法在表达GABAAR的爪蟾卵母细胞上检测到Dia的EC50值为44.0～71.9 μmol·L-1［14-15］，本方法灵敏度比该文献方法高14～22倍。采用本方法测得拮抗剂Gab的IC50值为（164.9±36.6）nmol·L-1。文献报道，用电生理方法在表达GABAAR的爪蟾卵母细胞上测得Gab的IC50值为（0.15±0.01）μmol·L-1［16］，本方法灵敏度与该文献报道方法基本相当。结果证实，本研究中构建并优化的GABAAR药物高通量检测方法检测灵敏度较高。

本研究建立并优化的GABAAR药物高通量筛选方法特异性好、精密度高，稳定可靠，灵敏度高，为靶向GABAAR的镇静睡眠类、抗焦虑等先导化合物的发现提供了良好的技术基础。