一氧化氮供体JS-K联合阿司匹林促进人肝细胞癌细胞凋亡

邢一浩，杨 成，铁 妍，贾雪珂，徐静蕾，刘 玲

（河南科技大学基础医学院，河南 洛阳 471003）

原发性肝癌（肝细胞癌，hepatic cell carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，在我国，HCC是死亡率仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤［1］。因此，对于HCC的防治，探索新的化学预防策略显得尤为重要。偶氮鎓二醇盐类衍生物O2-（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧羰基）哌嗪-1-基〕重氮-1-1，2-二醇酯（JS-K）是一种新型的一氧化氮（nitric oxide，NO）供体，它具有NO释放浓度高、靶向性好等优势。研究发现，JS-K可通过促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，激活线粒体凋亡途径，引起GSE-1细胞凋亡；通过增加细胞内Ca2+水平，引起线粒体膜电位下降，激活胱天蛋白酶3介导的线粒体途径，诱导HepG2细胞凋亡［2-3］。阿司匹林通过抑制环氧合酶（cyclooxygenase，COX）活性干扰前列腺素合成，发挥镇痛抗炎作用。研究表明，阿司匹林可通过上调Bax等凋亡相关蛋白表达促进HepG2细胞凋亡，抑制HepG2细胞增殖［4］。研究显示，JS-K和阿司匹林联用可显著上调活化转录因子3（activating transcription factor 3，ATF3），下调早期生长应答因子1（early growth response protein 1，EGR1），从而抑制胶质母细胞瘤增殖［5］。EGR1主要参与调控细胞增殖和分化，而ATF3可负向调控EGR1表达［6-7］。本研究选取了2种肝癌细胞系（HepG2细胞和SMMC7721细胞）为研究对象，探讨NO供体JS-K联用阿司匹林对其凋亡的影响及其机制，为肝癌提供新的治疗策略和研究方向。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂和仪器

人肝癌HepG2和SMMC7721细胞，由本实验中心保存。JS-K（美国Santa Cruz公司）；阿司匹林（美国Sigma公司）；Z-VAD-FMK（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM培养基和DAPI（北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清（以色列BI公司）；MTT（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒（美国BD公司）；兔抗人活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗人β肌动蛋白多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

Microfuge 20R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Axio Observer 3倒置荧光显微镜（德国蔡司公司）；DYCZ-40D电泳仪（北京六一科技有限公司）；全自动化学发光图像分析仪（上海天能科技有限公司）；BD AccuriC6流式细胞分析仪（美国BD公司）。

1.2 细胞培养和处理

取对数生长期HepG2和SMMC7721细胞，用含10%胎牛血清、青霉素100 IU·mL-1和链霉素100 μg·mL-1的DMEM高糖培养基培养，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中孵育。根据预实验结果，选取JS-K 5 μmol·L-1和阿司匹林5，10，20 mmol·L-1单用或联用处理细胞。将2种细胞分别随机分为细胞对照组（只加等量终浓度＜0.01%二甲亚砜）、JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林5，10和20 mmol·L-1组（同时给药）。以上分组药物单独或联用处理细胞24 h。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率

用0.25%胰酶常规消化后，将细胞密度调整至3×107L-1，每孔200 μL接种于96孔板内，待细胞贴壁后分组给药同1.2，每个浓度设6个复孔。培养24 h后，每孔分别加MTT溶液20 μL（5 g·L-1），4 h后弃去上清，每孔中分别加DMSO 150 μL，于黑暗环境振荡10 min后用酶标仪在490 nm处测定吸光度（A490nm）值。细胞增殖抑制率（%）=（1-药物组A490nm/细胞对照组A490nm）×100%。根据3次实验的细胞增殖抑制率使用CalcuSyn软件计算联合用药指数（combination index，CI）。CI＞1表示拮抗作用，CI＜1表示协同作用，CI=1表示相加作用［8-9］。

1.4 倒置显微镜下观察细胞形态

用0.25%胰酶消化细胞，调整细胞密度为3×107L-1，每孔200 μL接种于96孔板，按1.2分组加药，培养24 h后，于倒置显微镜下观察各个浓度下细胞形态的改变。

1.5 AnnexinV-FlTC/Pl双染法检测细胞凋亡率

用0.25%胰酶消化细胞，调整细胞密度为5×108L-1，每孔2 mL接种于6孔培养板，培养至细胞融合80%后按1.2分组加药。培养24 h后收集上清和细胞，于室温367×g离心5～10 min，预冷PBS重悬细胞1次，367×g离心5～10 min，洗涤细胞，加入300 μL的结合缓冲液悬浮细胞，加5 μL的AnnexinV-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min再加入5 μL PI染色，并补加200 μL结合缓冲液。1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 DAPl染色检测细胞凋亡

将对数生长期的HepG2和SMMC7721肝癌细胞，用0.25%胰酶常规消化后，调整细胞密度3×107L-1，每孔500 μL接种于48孔板。实验分为6组：细胞对照组、Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林 20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1+Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1组（Z-VAD-FMK 提前1 h加入）。培养至细胞融合80%后加药处理，孵育24 h后，加适量DAPI染色液，在室温下孵育5 min后，弃DAPI染色液，PBS洗3次，置荧光显微镜下观察细胞的形态。

1.7 Western印迹法检测活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达

将对数生长期的HepG2和SMMC7721肝癌细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，调节细胞密度3×107L-1，2 mL种于6孔板内。按1.6细胞分组给药后，置培养箱中孵育24 h后，使用细胞刮刀收集各组细胞，367×g离心5 min，然后用预冷PBS缓冲液洗涤2次。加裂解液提取总蛋白，并采用BCA法测定总蛋白含量，调整各组的蛋白浓度使其一致，然后各组分别加5×上样缓冲液振荡均匀，沸水浴5 min使蛋白质充分变性，进行SDS-PAGE并湿转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉在摇床上封闭30 min，加（1∶1000）稀释的一抗后在4℃过夜。用TBST洗膜液洗3次，每次5 min，加（1∶3000）稀释的二抗室温1 h，之后用TBST洗膜液洗3次，每次5 min，之后加化学发光液扫描图像。采用Image J软件对蛋白印迹条带进行积分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。以目标蛋白和内参蛋白的IA值之比表示蛋白相对表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 JS-K与阿司匹林联用对人肝癌细胞增殖抑制率的影响

MTT结果（表1）显示，与细胞对照组比较，JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林5，10和20 mmol·L-1组HepG2和SMMC7721细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.01）；与JS-K 5 μmol·L-1组比较，JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 5，10和20 mmol·L-1组 HepG2细胞和SMMC7721细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.05，P＜0.01），两药具有协同效应（CI＜1）。

2.2 JS-K与阿司匹林联用对人肝癌细胞形态的影响

倒置显微镜下观察到（图1），JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林5，10和20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1组 HepG2 和SMMC7721细胞生长迟缓，形态不规则，细胞扁圆，细胞脱落悬浮于培养液中。

2.3 JS-K与阿司匹林联用对人肝癌细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC/PI双染结果（图2）显示，与细胞对照组比较，HepG2和SMMC7721细胞JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林 10 和 20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 5，10 和 20 mmol·L-1组及SMMC-7221细胞阿司匹林5 mmol·L-1组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。与JS-K 5 μmol·L-1组比较，2种细胞JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林5，10和20 mmol·L-1组凋亡率显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 JS-K与阿司匹林联用对人肝癌细胞凋亡形态的影响

DAPI染色结果（图 3）显示，JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林 20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1组的HepG2和SMMC7721细胞部分染色质出现浓缩状态，可见月牙形的典型凋亡特征；JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1组的细胞中核的染色质高度凝聚、边缘化，核碎裂等凋亡特征更加明显。JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1+Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1组细胞核的染色质高度凝聚、边缘化，核碎裂等凋亡特征减少。

2.5 JS-K与阿司匹林联用对人肝癌细胞活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3以及活化PARP蛋白表达的影响

Western印迹实验结果（图4）显示，与细胞对照组比较，JS-K 5 μmol·L-1组、阿司匹林20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1组、JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1+Z-VADFMK 50 μmol·L-1组的HepG2和SMMC7721细胞活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。与JS-K 5 μmol·L-1组或阿司匹林 20 mmol·L-1组比较，JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林20 mmol·L-1组细胞中活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3以及活化PARP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。与 JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1组细胞比较，JS-K 5 μmol·L-1+阿司匹林 20 mmol·L-1+Z-VAD-FMK 50 μmol·L-1组细胞中活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 讨论

本研究结果表明，NO供体JS-K 5 μmol·L-1和阿司匹林5，10和20 mmol·L-1均可显著抑制肝癌细胞HepG2和SMMC7721的增殖，镜下可观察到细胞脱落悬浮于培养液中的数量增加，贴壁细胞数量明显减少。其中，JS-K 5 μmol·L-1和阿司匹林20 mmol·L-1联合给药具有较好的协同作用（CI＜1）。有研究显示，JS-K作用胶质母细胞瘤细胞系LN229和U87细胞6 h后，可引起COX-2基因表达的上调（U87 17.2倍，LN229 6.7倍）［5］。而阿司匹林可抑制COX活性，在多种肿瘤细胞中显示了良好的抑制作用［10-11］。化疗药物也可通过诱导胱天蛋白酶3活化使COX-2表达增加，从而促进肿瘤细胞增殖；COX抑制剂可协同化疗药物如索拉非尼的抗肿瘤作用［12］。本研究结果表明，JS-K 5 μmol·L-1与阿司匹林5，10和20 mmol·L-1联用后，细胞凋亡率显著增加，如染色质浓缩、核碎裂的细胞不同程度增多，加入胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK后，具有凋亡特征的细胞相应减少，提示两药联用的作用机制与细胞凋亡通路激活有关。

细胞凋亡的过程实际上是胱天蛋白酶被活化并发生凋亡蛋白酶的级联反应。胱天蛋白酶9属于启动型胱天蛋白酶，当有其他辅助因子作用时，发生自我活化，激活下游的胱天蛋白酶。其中胱天蛋白酶3属于下游执行型胱天蛋白酶，能够特异性裂解底物，促使细胞凋亡［13］。PARP在应激条件下与DNA修复相关，在体内主要被胱天蛋白酶3剪切而活化，PARP剪切活化被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是胱天蛋白酶3激活的指标［14］。本研究结果表明，JS-K和阿司匹林联用能更好促进HepG2和SMMC7721 2种肝癌细胞中活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达增加，提示JS-K和阿司匹林联用后在一定程度上激活了胱天蛋白酶，触发了相应的胱天蛋白酶凋亡信号通路；加入泛胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK后，活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达明显降低，提示JS-K和阿司匹林联用可激活胱天蛋白酶级联反应，使相应活化蛋白表达增加，从而触发凋亡的发生。

综上所述，JS-K联合阿司匹林对HepG2和SMMC7721肝癌细胞具有显著抑制作用，通过激活胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3，使胱天蛋白酶3下游底物PARP激活，从而诱导细胞凋亡。本研究为进一步促进NO供体和COX抑制剂的联用提供了重要的理论基础和实验依据。