青娥丸方有效成分药动学药效学相关性研究

刘玲 翁泽斌 王恒 朱星宇 陈志鹏 吴丽

[摘要]研究青娥丸方中3種有效成分京尼平苷酸、补骨脂素、异补骨脂素在大鼠体内的药代动力学过程与其抗骨质疏松作用的相关性。该实验通过大鼠灌胃给药青娥丸生品与盐炙品后，选取不同时间点进行眼眶取血，采用UHPLCMS/MS测定大鼠血浆中京尼平苷酸、补骨脂素和异补骨脂素的药物浓度，绘制药时曲线；以成骨细胞的增殖率为药效学指标，采用MTT法测定不同时间点含药血清作用于成骨细胞后的增殖率，绘制时效曲线。比较时效曲线和药时曲线可以发现，在成骨细胞的增殖率达到峰值时，京尼平苷酸和补骨脂素的血药浓度也在峰值附近，表明两者具有较好的相关性。而异补骨脂素的血药浓度峰值相对于药效峰值具有一定的滞后性。将青娥丸生品及盐炙品各成分的时效曲线与药时曲线进行拟合，进行相关性分析，发现盐炙品组各成分的相关性略高于生品组。上述实验结果表明，青娥丸中京尼平苷酸、补骨脂素的药时曲线和时效曲线具有良好的相关性，且与生品相比，青娥丸盐炙品中两者的相关性更高。

[关键词]青娥丸； 药动学； 药效学； 京尼平苷酸； 补骨脂素； 异补骨脂素

Analysis on pharmacokineticspharmacodynamics correlation of

effective ingredients of Qing′e wan

LIU Ling1，2， WENG Zebin3， WANG Heng1，2， ZHU Xingyu1，2， CHEN Zhipeng1，2， WU Li1，2， LI Weidong1，2*

（1 Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing， Nanjing University of Chinese Medicine， Engineering Center

for Standardization of Traditional Chinese Medicine Processing under State Ministry of Education， Nanjing 210046， China；

2 Pharmacy College of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China；

3 China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China）

[Abstract]To study the pharmacokinetics of three active ingredients in Qing′e wan， namely geniposidic acid， psoralen and isopsoralen， in rats， in order to investigate their correlation in the antiosteoporotic effect The rats were taken blood from their eye sockets at different time points after being orally administered with raw and saltprocessed Qing′e wan Geniposidic acid， psoralen and isopsoralen in rats plasma were determined by means of UHPLCMS/MS to draw the concentrationtime curve The proliferation rate of osteoblasts was taken as the pharmacodynamic index， and determined by MTT method to draw effecttime curve In comparison between the effecttime curve and the concentrationtime curve， the blood concentrations of geniposidic acid and psoralen were close to the peak when the cell proliferation rate reached its peak， indicating a good correlation between them The peak blood concentration of isopsoralen was slightly lagging behind the peak of efficacy According to the correlation analysis after fitting the effecttime curve and the concentrationtime curve， saltprocessed Qing′e wan had a better correlation than the raw one The above experimental results showed that the effecttime curve and the concentrationtime curve of geniposidic acid and psoralen had a good correlation， and the correlation of saltprocessed Qing′e wan was better than the raw one

[Key words]Qing′e wan； pharmacokinetics； pharmacodynamics； geniposidic acid； psoralen； isopsoralen

doi：10.4268/cjcmm20162323

青娥丸首载于宋代《太平惠民和剂局方》，并收载于2015年版《中国药典》，主要用于治疗肾虚腰痛，起坐不利，膝软乏力。处方组成为盐杜仲、盐补骨脂、核桃仁（炒）以及大蒜[1]。

方中君药杜仲能促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞活性[2]。研究表明，杜仲中京尼平苷酸、紫云英苷、黄芩苷、咖啡酸4种成分有促进成骨细胞分化成熟的能力，是杜仲抗骨质疏松的活性成分。其中京尼平苷酸还能抑制成骨细胞轉化为破骨细胞[3]。臣药补骨脂能刺激成骨细胞增殖，减少骨量丢失[4]；还有很强的雌激素样作用[5]。补骨脂中主要活性成分为香豆素类，包括补骨脂素和异补骨脂素等。补骨脂素具有植物雌激素作用[6]，能促进成骨细胞分化成熟[7]，抑制破骨细胞分化成熟[8]；异补骨脂素也具有雌激素样作用[9]，可选择性作用于雌激素受体，促进成骨细胞分化成熟[10]，还能与锌联合应用协同增效，促进成骨细胞相关转录因子的表达[11]，是补骨脂治疗骨质疏松的活性成分。基于方中杜仲、补骨脂药材的主要功效，结合两者主要化学成分的药理作用，复方青娥丸目前在临床上主要用于治疗骨质疏松症[1213]。实验采用UHPLCMS/MS监测青娥丸方中有效成分的药动学变化，以青娥丸生品与盐品含药血清对成骨细胞的增殖率为效应指标，评价青娥丸有效成分与其抗骨质疏松作用的相关性，进一步探讨青娥丸抗骨质疏松的药效物质基础。

1材料

11仪器与试剂

液相色谱输液泵（LC10ATvp泵，日本岛津公司）；5500 MS系统三重四级杆质谱仪（美国ABSCIEX公司）；BEHC18分析柱（21 mm×100 mm， 17 μm，Water公司）；C18保护柱（21 mm×10 mm， 17 μm，Water公司）。

京尼平苷酸（纯度>990%，四川维克奇生物科技有限公司）；大黄酸（纯度>990%，中国食品药品检定研究院）；补骨脂素（纯度>990%，上海友思生物技术有限公司）；异补骨脂素（纯度>990%，上海友思生物技术有限公司）；滨蒿内酯（纯度>990%，上海友思生物技术有限公司）；甲醇（色谱纯，加拿大Calepure公司）；甲酸（化学纯，德国Merk公司）；去离子水为实验室自制。

青娥丸生品：杜仲、补骨脂、核桃仁、大蒜，以上4味按2015年版《中国药典》制丸；青娥丸盐炙品：将杜仲、补骨脂生品按药典标准盐炙后，加核桃仁、大蒜按药典标准制丸。

12实验动物

SpragueDawley大鼠，雌性各半，体重180～220 g（南京中医药大学实验动物中心），动物合格证号SCXK（沪）20080016。

13细胞培养

绝经后妇女松质骨组织由江苏省中医院骨科提供，无菌条件取出绝经后妇女股骨松质骨组织，PBS冲洗3遍。剪成1 mm×1 mm×1 mm的骨片。放入培养皿（瓶）中，加入αMEM培养基，37 ℃培养24 h后，弃去培养基，PBS冲洗3遍，加入胰酶消化1 h，血清终止消化。加入含10%胎牛血清的αMEM培养液培养，每48 h更换培养液。7～14 d后细胞开始贴壁。细胞汇合铺满细胞瓶后，使用胰蛋白酶消化，1∶3传代培养，实验采用P3代细胞。

2方法

21青娥丸生品及盐炙品的制备

取青娥丸生品和盐炙品各10 g，置于圆底烧瓶内，精密加入超纯水100 mL，加热回流提取40 min，过滤，减压浓缩至01 g·mL-1，备用。

22供试品溶液中京尼平苷酸含量的测定

取21项制备的样品，分别精密吸取青娥丸生品和盐炙品供试品溶液各1 mL，用纯水稀释10倍，过滤（045 μm微孔滤膜），取续滤液作为供试品溶液。采用上述色谱条件，测定供试品溶液中京尼平苷酸、补骨脂素和异补骨脂素的含量，其中生品中京尼平苷酸、补骨脂素、异补骨脂素的质量分数分别为2126，2148，1563 mg·g-1；盐炙品中京尼平苷酸、补骨脂素、异补骨脂素的质量分数分别为3147，2159，2053 mg·g-1。

23药代动力学试验

231UHPLCMS/MS测定条件液相条件：流动相01%甲酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脱，0～2 min，5%～50%B，2～5 min，50%～95%B，5～6 min，95%B，6～61min，95%～5%B，流速03 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量5 μL。

负离子模式质谱条件：离子源为ESI源；CUR：35 psi（1 psi=6895 kPa）；CAD：8 V；IS：5 500 N；TEM：550 ℃；GS1：55 psi；GS2：55 psi；CE：-181 V；DP：-550 V；EP：-140 V；CXP：-90 V。用于定量分析的离子分别为[M+H]+m/z 3729/1229（京尼平苷酸）和m/z 2821/1830 （大黄酸）。

正离子模式质谱条件：离子源为ESI源；CUR：35 psi；CAD：8 V；IS：5 500 N；TEM：600 ℃；GS1：50 psi；GS2：60 psi；CE：3022 V；DP：8613 V；EP：653 V；CXP：969 V。用于定量分析的离子分别为[M+H]+m/z 1872/1310（补骨脂和异补骨脂素）和m/z 2072/1511（滨蒿内酯）。

232血清样品的采集及处理SD大鼠12只，随机分为生品组和盐炙品组，每组6只，实验前12 h禁食不禁水，实验期间自由饮水，实验12 h后进水。按照青娥丸水提物001 mL·g-1的灌胃剂量给药。分别于给药后010，025，050，075，100，150，250，400，600，1000，1200，2400 h经大鼠眼球后静脉丛采血约05 mL，置肝素化试管中，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，-20 ℃冷冻保存，备用。

取大鼠血清样品100 μL置于10 mL具塞离心试管中，加入内标液10 μL，摇振，再加入300 μL乙腈，涡旋混合3 min，4 000 r·min-1离心5 min，上清液转移至小EP管中，12 000 r·min-1高速离心3 min，取上清液5 μL用于UHPLCMS/MS分析。

24药效学实验

选择对数生长期中生长旺盛的人成骨细胞，按细胞密度为8×103个/孔，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h，棄去原培养液，换无血清培养液，饥饿细胞24 h，弃去无血清培养液，向96孔板中加入20%浓度的各时间点含药血清培养液，以含10%胎牛血清的培养液为空白对照，每药重复6个孔，每孔100 μL，分别培养48 h后，弃去培养液，加入5 g·L-1 的MTT溶液50 μL，37 ℃培养4 h后，吸净上清液，每孔加入150 μL DMSO，在摇床上振摇10 min使结晶充分溶解，用酶标仪在490 nm处测定吸光值。细胞增殖率=（A样品-A空白）/（A对照-A空白）×100%。

25统计学处理

实验中所有项目检测数据均以±s表示，采用Excel软件和药动学计算程序DAS 20处理，组间比较采用t检验。

3结果

31药动学结果

青娥丸生品及盐炙品的水提物灌胃给药后，采用已建立的UHPLCMS/MS分析方法，测定给药后不同时间点的大鼠血浆样品中京尼平苷酸、补骨脂素和异补骨脂素的浓度，结果见图1。动力学参数通过DAS 20软件进行处理，京尼平苷酸在大鼠体内的主要药动学参数见表1。从图1可知，灌胃给药青娥丸生品和盐炙品后京尼平苷酸、补骨脂素和异补骨脂素的药时浓度曲线差异比较明显，表明盐炙对青娥丸中成分体内吸收影响较大。从表1的药代动力学参数可见，青娥丸盐炙品组京尼平苷酸的Cmax，补骨脂素MRT和Tmax，异补骨脂素的AUC，MRT，Tmax与生品组相比具有显著性差异，其他参数也有不同程度的升高，可能与盐炙增加了有效成分的溶出有关。

32药效学结果

青娥丸生品及盐炙品的水提物灌胃给药后，不同时间点的血清对成骨细胞具有一定的促增殖作用，其时间效应曲线见图2。

33药动学与药效学相关性分析

采用 DAS 20 软件，对京尼平苷酸、补骨脂素、异补骨脂素血药浓度（X）与成骨细胞增殖率（Y） 进行量效关系分析，用散点相关法，X取对数进行作图，见图3，以Y=a+b·lnX数学模型进行拟合，结果见表2。

由图3可以看出，京尼平苷酸、补骨脂素和异补骨脂素的血药浓度与青娥丸生品及盐炙品含药血清促成骨细胞增殖能力之间具有良好的相关性，当京尼平苷酸血药浓度达到最大值时，其成骨细胞增殖率也达到最大值；当成骨细胞增殖率达到最大值时，补骨脂素和异补骨脂素的血药浓度也接近最大值，显示具有良好的相关性。

4讨论

根据受体动力学原理，药物进入机体后，先与体内特殊部位如受体相结合才能产生效应，药效强度与药物在靶部位的浓度相关。由于靶部位的药物浓度难以直接测定，一般通过检测血液中药物的浓度间接反映靶部位药物浓度，并以其预测药效强度，指导临床用药。但有时靶部位药物浓度与血药浓度并不一致，药效的消长规律也不一定与血药浓度变化过程完全同步。因此，研究药物动力学和药效动力学的相互关系，建立两者的相关性模型，对临床合理用药以及研究药物体内过程和作用机制具有重要意义。

现代研究表明，杜仲盐炙后能促进京尼平苷酸的吸收，增加其生物利用度[14]。补骨脂中补骨脂素与异补骨脂素在大鼠血液中的吸收与消除过程都较慢[15]，盐炙后能促进补骨脂素和异补骨脂素的体内吸收[16]。现有的研究大多关注于单味药材中单体化合物的药效学或药动学，未将两者结合，也鲜有研究中药复方活性成分PKPD的相关性。而中医药治疗疾病，基本是将中药配伍成复方用于临床，或制成不同剂型后进入体内起效，所以对于中药复方的研究尤为重要。本实验以复方青娥丸为研究对象，将京尼平苷酸、补骨脂素和异补骨脂素的药动学与其促进成骨细胞增殖作用的药效学结果相结合，探讨3种成分药动学与抗骨质疏松作用药效学的相关性，更能阐明复方青娥丸抗骨质疏松作用的药效物质基础，从而更好地指导临床用药，该研究模式将在中药复方的研究中起到一定的示范作用。

实验结果发现，灌胃给予生品及盐炙品青娥丸水提液后，大鼠含药血清对成骨细胞的增殖均有促进作用，且盐炙品的效果较好。比较时间效应曲线和血药浓度时间曲线可以发现，在细胞增殖率达到峰值时，京尼平苷酸和补骨脂素的血药浓度也在峰值附近，两者具有较好的相关性。异补骨脂素的血药浓度峰值相对药效峰值具有一定的滞后性。比较生品及盐炙品各成分的药动药效相关性发现，盐炙品组各成分的相关性略高于生品组（异补骨脂素除外）。揭示盐炙后青娥丸中京尼平苷酸和补骨脂素与药效的相关性更高。

由于中药药效是多种成分相互协同作用的结果，故以中药某一单体成分进行药动学和药效学研究，并不能完全反映中药复方的真实情况。后续实验中，应建立中药多成分、多靶点的药动学和药效学研究，并建立合适的数学模型，更好的为临床用药提供参考。

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[责任编辑曹阳阳]