半胱氨酰白三烯受体1调节APP/PS1小鼠原代神经元β淀粉样蛋白生成及机制

龙 燕，柯 璇，洪 浩

（中国药科大学药学院药理系，江苏 南京 211198）

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种临床表现为记忆缺失、认知能力下降、空间视觉损害、执行功能减退和人格改变等多方面神经功能障碍的神经退行性疾病［1］。AD的主要病理特征为脑内神经元外β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成的老年斑和神经元内高度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经元纤维缠结［2］。AD是由遗传、环境、炎症和年龄等多种因素导致的疾病，目前对于其发病机制提出了多种假说，Aβ级联假说占据AD 发病机制的主导地位［3］。Aβ 主要有 Aβ1-40和Aβ1-422种，由β淀粉样前体蛋白切割酶1（β-site of amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）和γ分泌酶先后剪切淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）产生［4］，两者在脑内浓度比是10∶1，而Aβ1-42疏水性强、毒性大，易聚合成具有生物活性的构象类型，形成老年斑沉淀的核心，并可能引发AD［5］。迄今为止，治疗AD的药物仅能暂时缓解症状，均不能阻止AD的发展进程，且不良反应较大［6］。目前，抑制脑内Aβ聚集、促进Aβ清除是研究AD防治药物的重要策略之一［7］。

半胱氨酰白三烯受体1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLT1R）是一种G蛋白偶联受体，由6个亲水环连接7个跨膜疏水区组成［8］。近年来研究发现，在脑缺血、脑外伤和脑脊髓炎等疾病动物模型中，中枢CysLT1R被过度激活，且与神经功能受损显著相关，而CysLT1R拮抗剂可产生明显的保护作用［9-12］。本课题组前期研究结果显示，CysLT1R参与多种因素诱导的动物认知功能障碍，且CysLT1R拮抗剂普仑司特（pranlukast，Pran）可以显著改善Aβ诱导的AD模型小鼠的认知功能障碍［13-16］。与老龄对照组相比，AD患者前额叶皮质CysLT1R水平升高了2倍，并且APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠（APP/PS1小鼠）的CysLT1R mRNA和蛋白水平随着年龄的增长而增加［17］。表明CysLT1R可能在AD的发病过程中起着重要作用。本研究旨在探究CysLT1R对APP/PS1小鼠皮质原代神经元中Aβ生成的影响及其可能的机制，为进一步阐明CysLT1R在AD发病过程中的重要作用提供理论依据，同时也为抗AD药物靶标的发掘提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性孕APP/PS1小鼠，约12周龄（孕16～18 d），体重50～60 g，购自南京大学模式动物研究所，动物许可证号：SCXK（苏）2015-0001。动物饲养于室温20～24℃、湿度40%～60%、光照时间8∶00-20∶00的实验室环境中，自由饮水摄食。本研究通过中国药科大学伦理委员会审批，编号为SYXK2016-0011。

1.2 药品、试剂和仪器

YM17690（批号：108806-41-3），上海康曼生物科技有限公司；Pran（批号：150821-03-7），美国Sigma-Aldrich公司；慢病毒-绿色荧光蛋白（lentivirusenhanced green fluorescent protein，LV-EGFP）载体（1×1012TU·L-1，批号：00015399）和LV-CysLT1REGFP载体（1×1012TU·L-1，批号：00015399），上海吉凯基因化学技术有限公司；脱氧核糖核酸酶Ⅰ和木瓜蛋白酶，白鲨生物科技有限公司；人Aβ1-40（批号：CSB-E06928Eq）和人 Aβ1-42（批号：CSBE10684h）ELISA试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；兔抗小鼠APP，BACE1和NF-κB P65单克隆抗体（批号：2452S，5606S和4764T），美国CST公司；兔抗小鼠PS1和PS2多克隆抗体（批号：sc-7860和sc-1456-R），美国Santa Cruz公司；兔抗小鼠CysLT1R多克隆抗体（批号：120500），美国Cayman Chemical公司；兔抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（批号：BM3873）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（二抗，批号：BA1039），博士德生物工程有限公司；NP-40蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟、多聚赖氨酸和BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012），碧云天生物技术有限公司；膜蛋白、核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒（批号：C510002），上海生工生物工程股份有限公司；胰蛋白酶、兔抗小鼠 Aβ1-40（批号：44-348A）和 Aβ1-42（批号：27250018）多克隆抗体、胎牛血清、DMEM培养基、B27和Neurobasal培养基，美国Invitrogen公司。兔抗小鼠组蛋白3多克隆抗体（批号：ab1791）、兔抗小鼠Na+-K+-ATP酶单克隆抗体（批号：ab167390），美国Abcam公司。核定位序列多肽（nuclear localization sequence peptides，NLS-pep，序列：RKHSLSSMTYVPKKK）及其阴性对照多肽（none-NLS-pep，NON-pep，序列：SCFNPFLYYFAGENF），由吉尔生化（上海）有限公司合成，NLS-pep和NON-pep分别对应于小鼠CysLT1R序列中第311～325个和CysLT2R序列中第282～296个氨基酸，经高效液相色谱和质谱鉴定纯度达到90%。RT-6000型酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司；转移电泳槽和转移电泳仪，美国Bio-Rad公司；Tanon4200型化学发光成像分析系统和Tanon3500型数码凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司。

1.3 APP/PS1小鼠皮质原代神经元的提取和培养

将APP/PS1孕鼠处死、消毒后取出胎鼠，在无菌环境下剪开胎鼠的颅腔，用眼科镊在冰浴的DMEM培养基中取皮质，去除脑膜和血管后剪碎。用脱氧核糖核酸酶Ⅰ和木瓜酶消化皮质组织，离心、去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，再次离心、去上清液后加入含10%胎牛血清DMEM培养基，轻轻吹打10次，静置2 min，取上清液加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，重复吹打步骤。将收集到的细胞悬液静置2 min，细胞计数，调整细胞密度至1×109L-1，接种于用多聚赖氨酸包被的6孔板中，每孔接种1 mL。接种30 min后换液，每孔加入含双抗和B27的Neurobasal培养基，置37℃5% CO2培养箱中培养。

1.4 APP/PS1小鼠皮质原代神经元转染LV-EGFP或LV-CysLT1R-EGFP

APP/PS1小鼠皮质原代神经元以2.5×108L-1的密度接种于6孔板中，每孔接种2 mL，正常培养1周。吸出旧培养基，加入1×1011TU·L-1的LV-EGFP或LV-CysLT1R-EGFP（分别用促转染溶液稀释）100 μL和聚凝胺50 mg·L-1（用Neurobasal培养基稀释）200 μL，并加入Neurobasal培养基至总液体量2 mL。12 h后，更换新鲜的含B27的Neurobasal培养基继续培养至120 h用于实验。

1.5 Western印迹法检测CysLT1R-OE神经元CysLT1R表达水平

以1.4方法转染LV-CysLT1R-EGFP，使神经元过表达CysLT1R（CysLT1R-OE）后收集细胞，加入含苯甲基磺酰氟的NP-40蛋白裂解液充分裂解，以16 770×g，4℃离心5 min，取上清。BCA法检测蛋白质含量。分别经电泳和转膜后加入一抗〔CysLT1R（1∶1000），β肌动蛋白（1∶3000）〕4℃孵育过夜；洗去一抗，加入相应二抗（1∶5000），室温孵育2 h。采用化学发光成像系统拍照，Gel-Pro软件扫描分析蛋白条带积分吸光度值。以目标蛋白与内参蛋白条带积分吸光度值的比值反映目标蛋白相对表达水平，各组数据以与对照组相比后的百分数表示。

1.6 ELlSA法检测CysLT1R-OE神经元培养基中A β1-40和 A β1-42含量

CysLT1R-OE转染方法同1.4。将神经元分为对照组（转染LV-EGFP后加入溶剂）、CysLT1R-OE组（转染LV-CysLT1R-EGFP后加入溶剂）、CysLT1ROE+YM17690组（转染LV-CysLT1R-EGFP后加入YM17690 1 μmol·L-1）和 CysLT1R-OE+YM17690+Pran组（转染LV-CysLT1R-EGFP后同时加入YM17690和Pran各1 μmol·L-1）。药物作用12 h后，收集各组细胞培养基，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定Aβ1-40和Aβ1-42含量。

1.7 Western印迹法检测CysLT1R-OE神经元胞质中APP，BACE1，PS1和PS2蛋白表达水平

CysLT1R-OE转染方法同1.4，实验分组同1.6。药物干预12 h后收集细胞，按照试剂盒说明书步骤分步提取胞质蛋白，加入一抗〔APP，BACE1，PS1和PS2（1∶1000）及β肌动蛋白（1∶3000）〕和二抗（1∶5000）。实验步骤及结果处理同1.5。

1.8 Western印迹法检测CysLT1R和NF- κB P65在CysLT1R-OE神经元中的分布

1.8.1 CysLT1R在CysLT1R-OE神经元中的分布

CysLT1R-OE转染方法同1.4。将神经元分为CysLT1R-OE组（转染LV-CysLT1R-EGFP后加入溶剂）、CysLT1R-OE+YM17690组（转染LV-CysLT1REGFP 后加入 YM17690 1 μmol·L-1）和 CysLT1ROE+YM17690+Pran组（转染LV-CysLT1R-EGFP后同时加入YM17690和Pran各1 μmol·L-1）。药物干预2 h后收集细胞，按照试剂盒说明书步骤分步提取膜蛋白、核蛋白和胞质蛋白。加入一抗〔CysLT1R、β肌动蛋白、组蛋白3和Na+-K+-ATP酶（1∶3000）〕和二抗（1∶5000）。其中，β肌动蛋白为胞质蛋白内参，组蛋白3为核蛋白内参，Na+-K+-ATP酶为膜蛋白内参。Western印迹法实验步骤及结果处理同1.5。各组数据以与CysLT1R-OE组相比后的百分数表示。

1.8.2 NF- κB P65在CysLT1R-OE神经元中的分布

CysLT1R-OE转染方法同1.4，实验分组同1.6。抗NF-κB P65抗体（稀释倍数1：1000），Western印迹法实验步骤及结果处理同1.8.1。

1.9 Western印迹法检测CysLT1R-OE神经元导入多肽后培养基内A β1-40和 A β1-42、胞质内 APP 和BACE1蛋白表达水平及CysLT1R和NF- κB P65亚基在细胞的分布

1.9.1 渗透差法将NLS-pep或NON-pep导入CysLT1R-OE神经元

CysLT1R-OE转染方法同1.4。将CysLT1R-OE神经元分为：CysLT1R-OE组（加入溶剂），CysLT1ROE+YM17690 组（加入 YM17690 1 μmol·L-1），CysLT1R-OE+NON-pep+YM17690（导入NON-pep后随即加入 YM17690 1 μmol·L-1），CysLT1R-OE+NLS-pep+YM17690（导入NLS-pep后随即加入YM17690 1 μmol·L-1）。实验前取 100 mg NLS-pep或NON-pep溶于10 mL高渗导入液（含蔗糖171.15 g·L-1、10%聚乙二醇和10%胎牛血清的DMEM溶液）中，制成高渗多肽导入液，每孔2 mL加入6孔板中，室温孵育10 min，而后迅速更换为低渗液（3.5 mL DMEM用6.5 mL灭菌双蒸水稀释），室温孵育2 min。重复上述操作2次。

1.9.2 导入多肽后CysLT1R在CysLT1R-OE神经元的分布

CysLT1R-OE神经元导入多肽后随即加入YM17690 1 μmol·L-1孵育2 h，收集细胞，按照试剂盒说明书步骤分步提取膜蛋白、核蛋白和胞质蛋白。加入一抗〔CysLT1R（1∶1000），β肌动蛋白、组蛋白3和Na+-K+-ATP酶（1∶3000）〕和二抗（1∶5000）。Western印迹法实验步骤及结果处理同1.5。各组数据以与CysLT1R-OE组相比后的百分数表示。

1.9.3 导入多肽后NF- κB P65亚基在CysLT1R-OE神经元的分布

CysLT1R-OE神经元分组同1.9.1。加入YM17690孵育2 h后收集细胞，按照试剂盒说明书分步提取细胞的核蛋白和胞质蛋白。加入一抗〔NF-κB P65（1∶1000），β肌动蛋白和组蛋白3（1∶3000）〕和二抗（1∶5000）。Western印迹法实验步骤及结果处理同1.9.2。

1.9.4 导入多肽后CysLT1R-OE神经元培养基A β1-40和 A β1-42水平及胞质中APP和 BACE1蛋白表达水平

CysLT1R-OE神经元分组同1.9.1。加入YM17690孵育12 h后分别收集培养基和神经元。以1.5方法提取神经元的胞质蛋白。加入一抗〔Aβ1-40，Aβ1-42，APP和BACE1（1∶1000）；β肌动蛋白（1∶3000）〕和二抗（1∶5000）。通过Western蛋白印迹法检测培养基中Aβ1-40和Aβ1-42水平及胞质中APP和BACE1蛋白表达水平。Western印迹法实验步骤及结果处理同1.9.2。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 APP/PS1小鼠皮质原代神经元转染LV-CysLT1REGFP后过表达CysLT1R

转染LV-CysLT1R-EGFP 120 h后，与对照组相比，CysLT1R-OE组APP/PS1小鼠皮质原代神经元中CysLT1R蛋白表达水平显著增加（P＜0.01）（图1）。

2.2 激活或竞争性抑制CysLT1R对CysLT1R-OE神经元培养基内A β及胞质内APP，BACE1，PS1和PS2表达水平的影响

ELISA结果（图2）显示，与CysLT1R-OE组相比，CysLT1R-OE+YM17690组神经元分泌Aβ1-40和Aβ1-42显著增加（P＜0.05）；而CysLT1R-OE+YM17690+Pran组神经元分泌Aβ1-40和Aβ1-42无明显变化。Western印迹法结果（图3）显示，与CysLT1R-OE组相比，CysLT1R-OE+YM17690组神经元中APP，PS1和PS2表达水平无显著变化，但BACE1表达水平显著增加（P＜0.05）；而CysLT1R-OE+YM17690+Pran组中BACE1的表达无明显变化。

2.3 激动CysLT1R对该受体和NF- κB P65亚基核转位的影响

Western印迹结果显示，与CysLT1R-OE组相比，CysLT1R-OE+YM17690组CysLT1R在神经元细胞膜和细胞质中蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），而在细胞核中表达水平显著升高（P＜0.05）（图4）；NF-κB P65亚基在细胞质中表达水平显著下降（P＜0.05），而在细胞核中表达水平显著升高（P＜0.05）（图5）。

2.4 YM17690对导入NLS-pep的CysLT1R-OE神经元内CysLT1R和NF- κB P65亚基分布的影响

Western印迹结果（图6）显示，与CysLT1ROE+YM17690组相比，CysLT1R-OE+NLS-pep+YM17690组神经元CysLT1R和NF-κB P65亚基在细胞核中表达水平显著下降（P＜0.05），CysLT1R和NF-κB P65亚基在胞质中表达水平显著升高（P＜0.05），CysLT1R在细胞膜上表达水平显著升高（P＜0.05）；而CysLT1R-OE+NON-pep+YM17690组神经元CysLT1R和NF-κB P65亚基在细胞核、胞质中和细胞膜上的表达水平均未见上述改变。

2.5 YM17690对导入NLS-pep的CysLT1R-OE神经元培养基中 A β1-40和 A β1-42及胞质中 APP 和BACE1蛋白表达水平的影响

Western印迹结果（图7）显示，与CysLT1ROE+YM17690组相比，CysLT1R-OE+NLS-pep+YM17690组神经元培养基中Aβ1-40和Aβ1-42表达水平明显下降（P＜0.05），胞质中BACE1表达水平明显下降（P＜0.05），胞质中APP表达水平无明显变化；而CysLT1R-OE+NON-pep+YM17690组神经元培养基中Aβ1-40和Aβ1-42及胞质中BACE1和APP表达水平均未见明显变化。

3 讨论

有研究表明，CysLT1R在APP/PS1小鼠脑内的表达随年龄的增长而增加，并与Aβ沉积的增加量和行为缺陷的严重程度密切相关［18］。CysLT1R是一种G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，GPCR），其内源性配体是CysLT类物质，包括LTC4，LTD4和LTE4等［19］。本课题组前期研究发现，伴随着CysLT1R的激活，NF-κB通路随后被激活，且CysLT1R介导的NF-κB激活参与了LTD4诱导的Aβ表达上调及BACE1和γ分泌酶活性增强［13-15］。长久以来，GPCR都被视为一类细胞表面受体，但CysLT1R的配体LTD4可诱导CysLT1R从质膜转移到细胞核，产生核转位［20］。YM17690是一种选择性CysLT1R激动剂，稳定性良好［14］。本研究采用YM17690激活CysLT1R后，该受体发生核转位，且CysLT1R核转位与调节Aβ生成有关。亲核蛋白的核输入通常依赖于核转运蛋白对的识别，已有证据显示，CysLT1R氨基酸序列中包含一段经典NLS，而NLS的突变可抑制CysLT1R的核转位［21］。NLS-pep的氨基酸序列与CysLT1R的NLS相同，向神经元中导入NLS-pep可使核转运蛋白对CysLT1R的识别和转运趋于饱和，从而竞争性地抑制受体本身的核输入。本研究结果显示，NLS-pep特异性抑制APP/PS1小鼠皮质原代神经元中CysLT1R的核转位，进而抑制了CysLT1R对Aβ1-40和Aβ1-42生成的调节作用。本研究通过检测NF-κB的细胞内分布验证CysLT1R核转位与NF-κB通路激活之间的关系，结果发现，CysLT1R发生核转位的同时NF-κB P65亚基也发生核转位，且该现象可被CysLT1R受体拮抗剂Pran和NLS-pep抑制。此外，本课题组在APP-HEK293细胞中通过免疫共沉淀实验发现，CysLT1R与NF-κB P65亚基在细胞核内存在相互结合（结果待发表），推测CysLT1R核转位是激活NF-κB信号通路的重要事件。

有研究证明，在人BACE1启动子中有4个NF-κB结合元件，其中2个与NF-κB P65亚基相互作用。NF-κB P65亚基通过结合BACE1启动子上的NF-κB结合元件，显著增强BACE1启动子活性［22］，BACE1对APP的切割是Aβ生成的限速步骤［23］。本研究发现，激活CysLT1R可上调BACE1的表达，并促进Aβ1-40和Aβ1-42的生成。提示，激活CysLT1R可引起其内化与核转位，从而引起NF-κB P65亚基的核转位而激活NF-κB信号通路，后者可能通过上调BACE1表达，进而促进APP/PS1皮质原代神经元生成Aβ。有文献报道，Aβ1-42可促进NF-κB报告基因的转录，进而引起 NF-κB P65 亚基核转位［24］；NF-κB通路激活可引起B淋巴细胞中促炎细胞因子和趋化因子的转录，诱导星形胶质细胞损伤或Aβ生成，从而导致AD［25］。

综上所述，CysLT1R被激活后发生核转位，受体核转位参与激活NF-κB信号通路并上调BACE1表达，这可能是CysLT1R调节Aβ生成增加的主要原因。