抗流行性感冒病毒药物研究进展

朱艳慧，刘雅琳，祝侠丽，蔡邦荣，贾永艳

（河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046）

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的传染病，具有高发病率和高死亡率的特点。流感病毒可借助空气迅速传播，引起呼吸道感染，免疫缺陷患者感染易患严重的并发症，如肺炎或急性呼吸衰竭等［1］。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2019年报道，全球每年估计有10亿流感病例，其中300万～500万重症病例，29万～65万死亡病例［2］。接种疫苗是减轻流感流行的有效手段，但儿童、老年人、慢性呼吸道疾病患者和孕妇等易感人群易出现严重并发症，需及时使用抗病毒药物治疗降低该风险。另外，疫苗研发具有滞后性，有效的抗病毒药物治疗可延迟或阻断病毒传播［3］。目前，直接靶向流感病毒蛋白或基因及靶向参与病毒复制和传播的关键宿主因子是抗流感病毒药物研发的有效策略［4］。

流感病毒属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）家族，是分节段单链反义RNA病毒。根据病毒基质蛋白1（matrix 1，M1）和核蛋白的抗原性，可将流感病毒分为甲型（influenza A virus，IAV）、乙型（influenza B virus，IBV）、丙型（influenza C virus，ICV）和丁型（influenza D virus，IDV）。IAV根据其表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的分子特征又可分为不同亚型，迄今鉴定的有18种HA亚型（H1～H18）和11种NA亚型（N1～N11）［5］。IAV可感染人、动物和禽类等多种物种，易受到抗原变异的影响。抗原变异与表面蛋白HA和NA的变化有关，通常被归类为抗原漂移（antigenic drift）或抗原转变（antigenic shift）。抗原漂移包括HA或NA蛋白的小的、渐进的氨基酸取代，这可能导致流感小规模暴发。当HA或NA蛋白发生显著变化时，抗原转变就会产生新的流感病毒亚型，有可能引起流感大规模流行；而每个流感病毒亚型都同时编码HA和NA蛋白（如H3N2和H5N1）［6］。

图1为流感病毒依靠宿主细胞进行复制涉及的多个步骤［7］。HA与细胞表面的唾液酸（sialic acid，SA）受体结合后，病毒颗粒被内吞进入细胞，形成内吞体。此时，离子通道蛋白M2被激活，离子通道打开，允许H+进入病毒；pH值降低到5.0时，内吞体膜与病毒包膜融合，病毒粒子中的病毒RNA（viral RNA，vRNA）被释放到细胞质中（脱壳）。vRNA与RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）被输运到细胞核进行转录和复制。合成的RNA不含mRNA所必需的帽子（Cap）结构，RdRp的Cap依赖性内切酶将宿主mRNA的Cap结构切除并转移到vRNA上，形成病毒mRNA（抢帽反应）。vRNA被转录成mRNA，用于产生病毒蛋白，并通过互补RNA（complementary RNA，cRNA）进行复制。病毒蛋白和RdRp-RNA复合体形成病毒颗粒，随后从细胞膜上出芽。从细胞表面生长出来的病毒颗粒上的HA与被感染细胞表面的SA受体结合，NA通过水解SA受体释放出病毒颗粒，成为具有感染力的新病毒。

截至2020年，美国和日本已批准用于临床治疗的主要抗流感病毒药物见表1。其中，美国疾病控制与预防中心（CentersforDiseaseControland Prevention）推荐奥司他韦（oseltamivir，Tamiflu）、扎那米韦（zanamivir，Relenza）、帕拉米韦（peramivir，Rapivab）和巴洛沙韦（baloxavir marboxil，S-033188，Xofluza）用于治疗急性无并发症的非妊娠期门诊流感患者［8］；拉尼米韦（laninamivir，Inavir）和法匹拉韦（favipravir，T-705，Avigan）在日本被批准作为抗流感药物［9-10］。

表1 截至2020年已批准用于临床治疗的主要抗流感病毒药物

目前，正处于非临床和临床研究阶段的抗流感病毒药物主要包括HA抑制剂、M2离子通道蛋白抑制剂、RdRp抑制剂和神经氨酸酶抑制剂等。本文综述抗流感病毒药物的抗病毒活性、作用机制和临床应用的研究进展，以期为研发具有广谱活性的新型抗流感病毒药物提供参考。

1 靶向血凝素的抗流感病毒药物

流感病毒HA不但介导与SA受体的结合，还参与病毒包膜与内吞体膜的融合。HA分子作为同源三聚体聚集在病毒粒子表面形成外部尖峰，具有高度的α螺旋二级结构，处于亚稳态，疏水融合肽隐藏在分子的底部［11］。HA蛋白形成膜远端口袋作为结合位点，构成袋子的氨基酸残基通过氢键和范德华力与宿主细胞膜上SA受体相互作用进入细胞内。HA1（重链）是宿主细胞受体结合的关键位点；而HA2（轻链）是体内融合的关键位点［12］。在内吞体低pH环境下，HA发生构象变化，HA前体（HA0）经剪切后形成HA1和HA2，将埋藏的HA2融合肽挤压到HA分子的远端。新形成的HA2 N端融合肽插入内吞体膜导致两膜合并，形成明显的半融合中间体，然后形成融合孔，病毒核糖核蛋白复合体从内吞体通过融合孔释放到细胞质中［13］。

目前，抑制HA与SA受体的结合阻断病毒感染是抗流感病毒药物研发的重要策略。根据其靶标不同，抑制病毒吸附的抗流感病毒药物可分为4类（表2）。

表2 靶向血凝素（HA）的抗流感病毒药物

1.1 血凝素前体糖基化抑制剂

HA0的头区在几个位置有大量糖基化。HA的糖基化与受体结合特异性、毒力、传导性和抗体免疫应答有关。硝唑尼特（nitazoxanide）是噻唑内酯类抗感染药物，用于治疗儿童和成人隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫引起的肠炎，其活性循环代谢物替唑尼特（tizoxanide）对多种流感病毒株均具有抗病毒活性［14］。硝唑尼特可通过阻断HA末端糖基化和损害内质网和高尔基体之间的HA0转运对H1N1具有抗病毒活性。噻唑内酯类在翻译后水平通过选择性阻断HA在抗糖苷内切酶H消化之前阶段的成熟，从而损害HA细胞内转运及插入宿主细胞膜，这是病毒正确组装和从宿主细胞释放的关键步骤。目前，硝唑尼特在美国已完成治疗≥12岁无并发症流感患者的Ⅲ期临床试验（NCT03336619）［15］。衣霉素（tunicamycin）是一种核苷类抗生素，具有N-糖基化抑制作用，具有广谱抗病毒作用，但细胞毒性限制了其应用；而IW3和IW7（2-脱氧尿苷衍生物）靶向病毒糖蛋白成熟过程中的多糖加工步骤，对IAV复制有较强的抑制作用［16］。

1.2 血凝素前体裂解抑制剂

蛋白酶将HA0裂解为HA1和HA2是病毒融合的第一步。在体外实验中，需要将胰蛋白酶添加到细胞培养基中，促进流感病毒感染。因此，蛋白酶抑制剂是一种有效的抗病毒策略。抑肽酶能抑制引起流感病毒激活的丝氨酸蛋白酶，俄罗斯已批准抑肽酶作为抗流感药物，雾化吸入用于治疗轻度到中度流感；静脉滴注用于治疗严重流感减少全身病理学和炎症反应［17］。丝氨酸蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽（leupeptin）［18］和卡莫司他（camostat）［19］均可抑制HA0裂解，并通过作用于HA裂解位点上的单一精氨酸限制人类和禽流感病毒的繁殖。最近，卡莫司他又被用于治疗新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）［20］。6-氨基己酸在儿童患者中可缩短流感病毒抗原在鼻咽上皮中的持续时间，并将流感症状的持续时间缩短至原时间的2/3～1/2，其吸入给药可发挥最有效的抗病毒作用和治疗效果［21］。但选择一种蛋白酶抑制剂只特异性地作用于HA的裂解而不影响其他细胞蛋白酶，这是需要解决的一项难题。

1.3 血凝素吸附抑制剂

流感病毒通过HA与宿主细胞表面含SA低聚糖的糖蛋白和糖脂结合而引起感染，可通过去除SA受体或保护SA受体2个途径阻止病毒吸附，阻止其与HA结合。DAS181（流感酶）是一种46 ku的重组蛋白，由细菌SA酶催化域和黏膜细胞表面锚定序列组成，可切断分别表达在人上呼吸道和下呼吸道的SA α-2，6半乳糖受体和α-2，3半乳糖受体与宿主细胞表面的连接。在一项评估DAS181对季节性和大流行流感病毒感染疗效的完整Ⅱ期临床试验中，DAS181以每天10 mg·kg-1的吸入剂量连续给药5 d，可显著降低流感病毒滴度［22］。

再次，广告一直以来是媒介获得收入的主要途径[15]。广告盈利多通过两种方式，一是广告植入，二是投放广告。微信公众号通过优质内容积累一定人气后，可吸引广告商进行广告投放，此外，公众号的广告收益与粉丝量、点击量直接相关。由此看见，公众号的内容在间接吸引广告商方面发挥着重要作用。

1.4 血凝素膜融合抑制剂

HA作为一种病毒包膜蛋白，在病毒遗传物质进入感染细胞的细胞质过程中发挥重要作用。通过改变pH环境，阻止HA构象变化干预膜融合过程。MBX2546是一种（H1和H5亚型）IAV抑制剂，通过直接结合HA蛋白的茎区，靶向HA介导的病毒宿主膜融合。由于MBX2546与HA蛋白稳定结合，阻止了pH改变诱导融合所需的构象变化［23］。BMY-27709含有水杨酸酰胺骨架结构，可作为“分子胶”来抑制HA2融合肽的移动，阻断HA介导的融合过程，在感染早期发挥抗流感病毒作用，并且只对H1和H2亚型病毒有效，对H3亚型病毒无效［24］。阿比多尔（umifenovir，Arbidol）是一种广谱抗病毒药物，可抑制多种包膜和非包膜病毒，如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇B5、副流感病毒、埃博拉病毒以及乙型和丙型肝炎。阿比多尔结合在HA三聚体茎区的疏水腔中，通过分子胶作用稳定HA的预融合构象，在内吞体的低pH值环境中抑制与膜融合相关的构象重排，可用于治疗由IAV和IBV引起的上呼吸道感染。在俄罗斯和中国，阿比多尔主要作为非处方药物用于预防和治疗包括流感在内的急性呼吸道感染［25］。目前，在中日友好医院正在进行阿比多尔与奥司他韦联合用药治疗≥16岁严重流感患者的Ⅲ期临床试验（NCT03787459）［26］。但阿比多尔主要缺点是必须使用大剂量才能达到血浆浓度峰值和治疗效果，临床使用较少。另外，苯并醌类和对苯二酚类化合物可抑制低pH诱导的HA构象变化。这些化合物还可抑制病毒诱导的合胞体形成、HA介导的溶血和体外病毒感染。作用最强的叔丁基对苯二酚抑制H3N2病毒HA的构象变化，抑制体外培养细胞病毒感染的IC50值为5～10 μmol·L-1［27］。司他弗林（stachyflin）类化合物、罗汉松酸类衍生物和六氢吡啶类衍生物均可通过抑制低pH诱导的HA构象变化发挥抗流感病毒活性［28］，但当流感病毒HA糖基化缺失或减少时此类药物的抗流感活性会降低。

2 靶向离子通道蛋白M2的抗流感病毒药物

IAV和IBV含有不同的包膜蛋白，分别是AM2和BM2，发挥质子通道作用。流感病毒通过内吞作用进入感染的细胞后，包含在内吞体中的病毒粒子必须酸化才能脱壳将遗传物质释放到细胞质中。AM2和BM2是同源四聚体组成的Ⅲ型跨膜蛋白，由N端胞外区、单跨膜区和C端胞内尾区组成。AM2和BM2除跨内膜区残基HXXXW有相同之处，其他一级序列差异较大［29］。M2跨膜区的四聚体形成门控离子通道，当胞外区暴露于酸性环境时通道打开，选择性透过质子进入病毒颗粒内。病毒内pH降低促进病毒包膜与内吞体膜的融合，病毒核糖核蛋白复合体与M1解离然后进入宿主细胞核进行转录和复制。由于M2离子通道不仅可在病毒进入细胞后平衡病毒内pH，而且在病毒成熟期间平衡高尔基体膜pH，因此M2离子通道可作为有效的抗流感病毒靶标［30］。M2离子通道抑制剂可通过破坏螺旋结构的稳定性阻断质子跨膜转运，发挥药理学活性，主要有金刚烷胺和金刚乙胺及非金刚烷胺衍生物。

2.1 金刚烷胺和金刚乙胺

金刚烷胺是1966年批准用于治疗IAV感染的第一个抗病毒化合物，其通过M2蛋白通道阻断H+转运进入病毒颗粒内部，从而防止病毒颗粒脱壳。金刚烷胺被发现后，金刚乙胺及金刚烷胺衍生物被合成［31］。但只有金刚烷胺和金刚乙胺获准用于成人患者，它们对儿童和老年人IAV感染的预防、治疗或缩短病程无效。金刚烷胺和金刚乙胺可抑制AM2离子通道而不抑制BM2，所以两者只能抑制IAV而不抑制IBV。近年来，金刚烷胺很少使用，因为M2蛋白中第31位的氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，导致其在甲型 H1N1毒株〔A（H1N1）〕pdm09和A（H3N2）中普遍存在耐药性［32］。

2.2 非金刚烷胺衍生物

多胺类化合物如精胺、亚精胺和腐胺通常被认为是钾离子通道的内在整流器，并与通道孔衬里和侧面的酸性氨基酸残基相互作用。与金刚烷胺的结合位点不同，M2蛋白也具有多胺的结合位点，该位点通常被Na+掩蔽，可作为选择性抗病毒抑制剂靶点［33］。螺哌啶类及其衍生物对金刚烷胺耐药病毒株具有抗病毒活性，以螺哌啶-9作用最为显著。天然产物中，蒎那胺（pinanamine）衍生物和阿魏酸乙酯（24-E-ferulate）具有良好的抗流感活性［6］。

3 靶向RNA依赖性RNA聚合酶的抗流感病毒药物

流感病毒的转录和复制是由RdRp复合物催化完成的。流感病毒RdRp复合物是一种由酸性聚合酶（polymerase acidic protein，PA）、碱性聚合酶1（polymerase basic protein 1，PB1）和PB2 3个亚基组成的异源三聚体，以vRNA为模板，在转录过程中合成含有Cap、多聚腺苷酸化的mRNA，在复制过程中合成cRNA和vRNA［34］。PB1亚基与流感病毒vRNA和cRNA以不同的模式结合，执行RNA聚合酶功能；PB2亚基结合宿主细胞前体mRNA（pre-mRNA）的5′Cap结构；PA亚基具有内切酶活性，剪切宿主细胞前体mRNA的5′Cap结构用于病毒自身mRNA转录；最后形成具有5′甲基化Cap结构和3′poly（A）尾结构的流感病毒mRNA［35］。流感病毒基因组vRNA转录过程及潜在的抗流感病毒药物见图2和表3。

表3 靶向RNA依赖性RNA聚合酶的主要抗流感病毒药物

3.1 巴洛沙韦

巴洛沙韦由日本研发，于2018年2月23日获得批准，用于治疗感染IAV和IBV（年龄≥12岁患者和体重≥10 kg但年龄＜12岁儿童患者）；并于2018年10月24日在美国获得批准，2019年在其他几个国家获得批准，用于治疗症状出现时间＜48 h、年龄≥12岁且体重≥40 kg的急性无并发症的流感患者。目前，在中国已完成一项Ⅰ期单中心、单次口服巴洛沙韦（40或80 mg）在健康受试者体内的药动学、安全性和耐受性评价（NCT03959332）［36］。

巴洛韦酸（baloxavir acid，S-033447），是巴洛沙韦的活性形式，是基于多替拉韦（dolutegravir）的2个金属药效团概念经合理分子设计产生的。多替拉韦是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）整合酶的抑制剂，因为流感PA和HIV整合酶都是使用2个二价金属离子作为辅助因子发挥内切酶活性。为增强巴洛韦酸的口服吸收，添加酚羟基，制备巴洛沙韦。巴洛沙韦可被肠道、肝和血液中的酯酶快速水解为巴洛韦酸［37］。巴洛韦酸结合到PA内切酶结构域，并抑制PA对RNA的切割。巴洛韦酸与IAV的A20，Y24，K34，A37和I38或与IBV的T20，F24，M34，N37和I38在PA内切酶结构域形成范德华作用。巴洛沙韦的主要优点是只需1次给药，增加了依从性。以减轻症状的时间来衡量，巴洛沙韦似乎比奥司他韦无明显的临床优势，但其在治疗后24 h内减少病毒载量的能力使其在预防病毒传播方面更有优势。在严重并发症流感病例中，快速减少病毒载量可能会减轻病毒导致的炎症和对肺组织的损害，从而产生更好的临床效果［38］。Koshimichi等［39］报道，不论流感高危并发症患者或其他流感患者的暴露水平如何，给予巴洛沙韦（体重＜80 kg患者40 mg和体重≥80 kg患者80 mg），均可缩短流感症状时间，降低IAV和IBV病毒滴度。

3.2 AL-794

AL-794（ALS-033794/JNJ-64155806）是一种口服有活性的ALS-033719的异丁酸酯前药，选择性地结合于PA内切酶结构域，有效抑制内切酶活性。ALS-033719对29株IAV和IBV均有抑制作用，90%有效浓度（EC90）为2.3～267 nmol·L-1。对健康成人单次或多次递增剂量给予AL-794，评价其安全性及药动学。结果表明，ALS-033719的血浆浓度按递增剂量比例增加，最高可达150 mg，但＞150 mg时则不按比例增加；AL-794 200 mg，每天2次，可达到ALS-033719暴露剂量，预期有效且普遍耐受［40］。在一项Ⅰ期临床研究中，健康受试者经鼻接种A/Perth/16/2009 H3N2，12 h后poAL-794 50或150 mg，每天2次，连续给药5 d。结果显示，AL-794具有明显抗病毒活性，150 mg剂量组病毒载量、症状和黏液重量与50 mg剂量组相比明显降低，且无安全问题［41］。患者可耐受AL-974，无严重不良事件，最常见的不良反应为轻度头痛和头痛。2017年5月完成了在健康志愿者中AL-794与奥司他韦和匹莫迪韦（pimodivir，JNJ63623872，VX-787）药动学相互作用的Ⅰ期临床评估（NCT02888327）［42］。但2018年4月在健康志愿者中评估其重复给药方案的安全性、耐受性和药动学的临床研究被终止（NCT03411421）［43］。

3.3 法匹拉韦

法匹拉韦是一种取代吡嗪化合物，在细胞中磷酸化代谢成其活性形式法匹拉韦-核呋喃糖基-5′-三磷酸（ribofuranosyl-5′-triphosphate，RTP）。法匹拉韦-RTP以浓度依赖和GTP竞争的方式抑制流感病毒RNA聚合酶活性［44］。法匹拉韦被RdRp识别为嘌呤类似物，并作为鸟苷和腺苷模拟物有效地合并到新生RNA链中，阻止GTP和ATP竞争性结合，并抑制RNA延伸，阻止病毒复制和转录。此外，法匹拉韦通过增加G→A和C→U突变频率，导致致命的突变，产生不可存活的子代病毒［45］。因此，法匹拉韦具有新生RNA链终止剂或诱变剂的作用，对RNA病毒（包括流感病毒、鼻病毒和呼吸道合胞病毒）具有广谱抗病毒活性，但对DNA病毒无效。法匹拉韦治疗流感比奥司他韦有更好的疗效［46］，其在治疗致病性禽流感H5N1和对奥司他韦耐药病毒方面的疗效也已通过动物实验得到验证［47］。2014年，法匹拉韦在日本被批准用于治疗新型或再次流行的流感病毒，由于其潜在的不良反应，由政府指导用药，且被其作为储备药物用于应对严重流感治疗［11］。在日本，除流感外，法匹拉韦已被提交用于重症发热伴血小板减少综合征的附加适应证［48］。法匹拉韦与奥司他韦联合治疗严重流感患者的临床试验结果显示，奥司他韦75 mg，每天2次，连续给药10 d；法匹拉韦第1天给药1600 mg，第2～10天600 mg，均每天2次；与奥司他韦单药治疗相比，两者联合治疗可促进严重流感患者临床康复［49］。在病毒复制期间停止用药或出现耐药株时，病毒复制和发热将复发。由于季节性流感病毒的复制周期为6 d或更长，因此严重流感或新型流感治疗可能需要连续给药 10 d［50］。

3.4 利巴韦林

利巴韦林（ribavirin，Virazole）合成于1970年，在红细胞中磷酸化，生成三氮唑核苷单磷酸、二磷酸及三磷酸，具有广谱抗DNA和RNA病毒活性，包括IAV、IBV、呼吸道合胞病毒、丙型肝炎病毒和仙台病毒等［51-52］。利巴韦林可通过抑制肌苷单磷酸脱氢 酶（inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH）降低细胞内GTP，抑制mRNA 5′Cap形成，以及通过其与腺苷或鸟苷的相似性增加RNA复制中的突变，发挥抗病毒作用［53］。单磷酸利巴韦林抑制细胞内IMPDH；三磷酸利巴韦林（ribavirin 5′-triphosphate，RBV-TP）选择性抑制流感病毒的RNA聚合酶。利巴韦林被批准用于治疗呼吸道合胞病毒，并与干扰素或聚干扰素联合用于治疗丙型肝炎病毒。尽管利巴韦林潜在的致畸不良反应限制了其在临床中的应用，但其成功应用于流感的治疗，且未表现出耐药性的迹象［54］。利巴韦林衍生物LY217896（1，3，4-thiadiazol-2-ylcyanamide）及其钠盐在体内外均能抗IAV和IBV。塔利韦林（viramidine）是利巴韦林的3-羧脒衍生物，抗病毒疗效与利巴韦林相似，但毒性较小，未来有可能用于抗流感治疗［55］。在一项比较奥司他韦、金刚烷胺和利巴韦林联合给药与奥司他韦单药治疗的随机、双盲、多中心Ⅱ期临床试验中，奥司他韦（75 mg）、金刚烷胺（100 mg）和利巴韦林（600 mg）联合给药或奥司他韦单药治疗，每天2次，连续5 d，并对患者进行28 d的随访。结果显示，与单药治疗相比，联合用药虽在第3天显著降低病毒复制，但该差异与改善的临床受益无关［56］。

法匹拉韦和利巴韦林均为嘌呤伪碱，但它们对流感病毒的抗病毒和致突变的作用机制却不同。利巴韦林抗流感病毒作用是基于抑制IMPDH导致GTP快速消耗和核苷酸池的不平衡，而法匹拉韦被病毒聚合酶识别作为GTP竞争抑制剂阻止病毒复制和转录。在被病毒感染的细胞内，法匹拉韦或利巴韦林≥50 μmol·L-1时病毒RNA合成被完全抑制；而暴露在低药物浓度时则诱导非传染性病毒颗粒的形成以及病毒基因组中随机点突变的累积；法匹拉韦的诱变效应是利巴韦林的2倍［55］。RBV-TP直接靶向病毒基因组，被病毒聚合酶作为底物掺入到延长的RNA链中，导致多个碱基不匹配，从而导致致命突变［57］。而法匹拉韦-RTP被病毒聚合酶识别作为替代底物，使其不能识别GTP和ATP。单个法匹拉韦-核呋喃糖基-5′-单磷酸与vRNA的结合减慢但未停止vRNA的延伸，连续2个法匹拉韦-核呋喃糖基-5′-单磷酸的结合事件可阻止vRNA的进一步延伸［58］。

3.5 匹莫迪韦

匹莫迪韦是一种环己基羧酸类似物，在“抢帽反应”中，PB2结合到宿主mRNA的m7G Cap结构上。匹莫迪韦占据PB2的Cap结合区域，抑制RNA结合。匹莫迪韦与PB2 Cap结合区域的E361和K376形成氢键，其氮杂吲哚环夹在H357和F404之间，而嘧啶环与F323相互作用。匹莫迪韦的羧酸通过水介导与R355，H357和Q406相互作用［59］。匹莫迪韦可抑制IAV，包括对M2离子通道抑制剂耐药和NA抑制剂（NA inhibitor，NAI）耐药的病毒，但对IBV无效。这可能是由于IAV和IBV的PB2 Cap结合结构域的几个关键氨基酸存在差异，IBV Cap结合结构域的一些残基可对匹莫迪韦产生空间阻碍［60］。此外，IBV的Cap结合亲和力和特异性与IAV不同，IBV Cap结合亲和力弱于IAV；IAV对m7G Cap结构有严格的特异性，而IBV识别未甲基化Cap结构［61］。对感染IAV住院的老年患者（65～85岁）和非老年患者（18～64岁）进行匹莫迪韦联合奥司他韦的Ⅱb期临床研究，住院患者被随机分为匹莫迪韦600 mg和奥司他韦75 mg组，每天服药2次，连续7 d。结果显示，匹莫迪韦在老年和非老年患者中的药动学参数相似；匹莫迪韦缓解流感症状的时间（72.45 h）比安慰剂的时间（94.15 h）短；与安慰剂组（15.6%）相比，匹莫迪韦组流感相关并发症发生率（7.9%）较低；治疗耐受性一般良好［62］。

4 靶向神经氨酸酶的抗流感病毒药物

NA是同源四聚体Ⅱ型糖蛋白，嵌于流感病毒包膜表面，每个单体亚基折叠成4个不同的结构域：胞浆尾部、跨膜区、茎状区和催化头区域。在所有IAV中，胞浆尾部的序列几乎100%保守，在NA转运和合并过程中发挥关键作用［63］。但N端疏水跨膜结构域包含1个跨越残基（7～29的可变氨基酸序列），并提供转位到顶膜和脂质筏结合的信号。不同NA亚型的茎部结构域在氨基酸残基的数量和序列上有相当大的差异，影响NA酶活性和毒力。催化头区域具有从附近膜糖蛋白上裂解SA的能力，以防止病毒结合［64］。NA在流感感染过程中具有多个功能：①NA具有SA酶活性，裂解细胞表面SA，释放新形成的子代病毒颗粒，使其继续感染宿主细胞并传播感染。②NA对病毒在呼吸道黏液中的移动非常重要，可水解呼吸道中的SA，使呼吸道黏膜表面黏液降低，病毒更易感染底层上皮细胞［65］。③NA在病毒粒子进入宿主细胞过程中也发挥重要作用。首先，NA除拥有与SA及其类似物结合的催化位点外，还有第2个受体结合位点，可能在直接受体结合中发挥作用，与HA的受体结合功能互补；其次，NA可能有助于释放与唾液化“诱饵”受体结合的病毒粒子，促进病毒在细胞表面移动，从而使HA能够与受体表达的SA接触，进而发生内吞作用［66］。

早在1948年就提出了NAI的概念，NAI抑制病毒NA，导致病毒复制和传播受阻。目前为止，已上市NAI包括奥司他韦、扎那米韦、拉尼米韦和帕拉米韦。除拉尼米韦只在日本获得许可外，其他3种在世界范围内获得了治疗和预防流感感染的许可［14］。拉尼米韦是一次性吸入给药，因此可能具有较高的依从性，然而儿童，特别是＜3岁的儿童，吸入给药可能有困难［67］。帕拉米韦应静脉滴注＞15 min，通常用于治疗住院流感患者。奥司他韦和扎那米韦的用药时间比拉尼米韦和帕拉米韦更长，患者需连续给药5 d，且不能过早或当患者开始感觉好转时立即停止用药。Tochino等［68］在日本大阪进行了一项为期8年的调查，评价4种NAI对流感的治疗效果，结果显示，拉尼米韦最常用于年龄≥10岁的患者，而奥司他韦最常用于年龄＜10岁的患者；使用4种NAI具有类似作用，IAV患者均比IBV患者退热早，年龄较大患者更易发生低热（＜38℃）。

IAV具有高度的遗传变异性，其通过突变逃避宿主免疫反应，有时1个点突变就能产生对某些抗病毒药物的耐药性，且这种突变每时每刻都在发生。因此，需要持续监测和评估耐药病毒株的病毒适应度和传播能力。Lee等［69］报道，对于季节性流感病毒，NAI耐药率报道较少（奥司他韦＜3.5%，扎那米韦＜1.0%）；在幼儿（＜5岁）、免疫功能低下者和预防给药个人中，IAV（H1N1）病毒的耐药性风险略高于IAV（H3N2）和IBV。H275Y IAV（H1N1）突变株显示出高水平奥司他韦耐药，能够引起流感暴发；而且NAI对R294K IAV（H7N9）突变株抑制作用减弱。Mawatari等［70］评价4种NAI对 IAV（H1N1 pdm09和H3N2）和IBV的临床有效性。结果显示，拉尼米韦治疗表现出较长的发热持续时间；感染H275Y IAV（H1N1）pdm09突变株的儿童患者接受奥司他韦治疗，发热持续时间延长。

WHO流感参考和研究合作中心在2014年5月-2015年5月期间检测了WHO认可的国家流感中心收集的13 312种病毒，以确定4种NAI的50%抑制浓度（IC50）。结果显示，约有0.5%的病毒对4种NAI中至少一种表现出高度降低抑制（highly reduced inhibition，HRI）（n=68）或降低抑制（reduced inhibition，RI）（n=56）。在12种HRI病毒中，6种为 IAV（H1N1）pdm09病毒，3种为 IAV（H3N2）病毒，3种为IBV/Yamagata-lineage病毒。对NAI具有RI或HRI的病毒的发生率低于2013-2014年观察到的1.9%，但与2012-2013年期间的0.6%相似。根据目前的分析，虽然出现了一些耐药病毒株，但NAI仍然是治疗和预防流感病毒感染的有效选择［71］。

5 结语

流感的防治仍然是一个挑战。NAI和聚合酶抑制剂等抗病毒药物虽然为治疗流感患者提供了选择，但均有局限性。由于IAV M2蛋白中氨基酸位点的突变，导致金刚烷胺存在耐药性，且临床安全性不佳，需关注胃肠道不良事件和中枢神经系统毒性，已不被用于治疗流感。NAI是最常用的抗流感处方药物，可缩短流感病程，减轻流感相关并发症，降低死亡率。但流感病毒可通过在NA催化位点或HA受体结合位点获得突变而产生对NAI的耐药性，并且耐药率在全球逐渐增加，出现了NAI耐药病毒株的季节性暴发。NAI耐药性主要出现在长时间药物接触或亚治疗剂量药物治疗后，特别是儿童、免疫缺陷患者和预防服药者。在危重患者和需要住院治疗的重症患者中，即使早期使用了NAI，流感导致的发病率和死亡率仍然很高。RdRp对流感病毒转录、蛋白合成以及基因组复制等病毒复制周期至关重要，而且参与RNA结合、裂解和延伸作用的聚合酶活性位点保守，因此聚合酶抑制剂不易产生耐药性。法匹拉韦和巴洛沙韦可用于对金刚烷胺和NAI具有耐药性的病毒株。法匹拉韦作为广谱抗病毒药物已在我国上市，巴洛沙韦尚处于新药上市审评阶段。另外，将抗病毒药物与其他免疫调节药物如大环内酯、N-乙酰半胱氨酸、他汀类药物、非甾体抗炎药物和类固醇等联用，可能是治疗流感重症患者的有效策略之一。