miR-505靶向调控HMGB1逆转肝癌细胞阿霉素耐药

陆 林，张冬辉，徐 宇，杨景旭

0 引言

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是在全球范围内发病率较高的肿瘤，以发现晚、生存期短为特点[1]。手术、介入治疗、化疗及靶向治疗等方法是肝细胞癌目前主要的治疗手段。介入治疗是无法手术切除肝癌的主要治疗手段，但不能降低手术后复发率及延长生存期[2]。微波消融联合介入治疗在并发下腔静脉癌栓的患者中能够提高1～2年生存率，但总生存率没有改善[3]。在肝癌脑转移患者中联合应用靶向治疗也达到了一定程度延长生存期的目的[4]。因此，化疗及靶向治疗耐药仍然是生存率不能大幅度提高的主要因素。如何逆转化疗耐药也是研究的热点。多项研究表明，小RNA (miRNA)在多种恶性肿瘤中具有始动作用，并参与恶性肿瘤的进展及化疗耐药的调控[5-6]。本课题组前期研究显示，miR-505在肝细胞癌中为抑癌基因，并通过高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)调控阿霉素(Adriamycin，ADM)诱导的肝癌细胞侵袭、迁徙、凋亡及增殖[7]。基于前期研究，我们推断miR-505可能对肝癌细胞ADM耐药具有调控作用，本研究对miR-505及HMGB1在ADM耐药肝癌细胞中的表达进行了检测，并观察miR-505对肝癌细胞ADM耐药是否具有逆转作用，初步探讨其机制，为进一步在体实验提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 肝细胞癌细胞株MHCC97购自中国科学院上海细胞库，在锦州医科大学科学实验中心培养基传代。细胞培养采用贴壁细胞培养法。ADM(CAS No.25316-40-9)购自南京都莱生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天生物技术公司，miR-505 mimics及anti-miR-505购自中国Biomics公司，抗HMGB1多克隆抗体及抗β-actin多克隆抗体购自美国Sigma公司、All-in-OneTMqPCR Mix试剂盒购自美国GeneCopoeia Inc公司，MTT试剂盒及Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国Invitrogen公司，引物由南通Biomics生物技术股份有限公司设计合成。实验细胞分为MHCC97组(亲代细胞)，MHCC97/ADM组(ADM耐药细胞组)。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2 研究方法

1.2.1 MHCC97阿霉素耐药细胞株的建立 以MTT法检测MHCC97细胞在不同浓度梯度ADM处理后的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)，对MHCC97培养融合度达到70%以上的细胞根据IC50值1/3的起始浓度进行干预，培养24 h后采用PBS液对MHCC97细胞清洗3次，更换RPMI-1640培养基(含有胎牛血清)，每日清理死亡细胞，在细胞达到对数生长期后继续给予同浓度干预2次，继续培养，重复前述过程，给予倍增浓度继续干预细胞，每个浓度至少进行3次重复干预，时长共8个月，获得稳定生长的对ADM耐药的MHCC97/ADM细胞株。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 按照MTT试剂盒操作说明步骤，取各组对数期生长细胞以6 000个/孔的密度接种于96孔板进行孵育，接种24 h后给予不同浓度梯度的ADM干预各组细胞，设立复孔，给药后在24 h、48 h、72 h及96 h，加入MTT液，继续进行孵育，弃去上清液后加二甲基亚砜，震荡后用酶标仪测定不同时间点的吸光度，每组进行3次重复。

1.2.3 Western blot免疫印迹法检测蛋白表达 依照试剂盒操作说明书进行各组细胞的裂解及总蛋白提取，以BCA蛋白质测定试剂盒进行总蛋白浓度测定，以PBS液调整蛋白样品浓度，按比例混匀蛋白上样缓冲液及蛋白溶液进行煮沸变性。上样量为每道15 μg蛋白，浓缩胶为5%，SDS-PGAE分离凝胶为8%～10%，进行恒压电泳。以PVDF膜进行转膜。封闭后给予稀释的一抗孵育1 h，之后加入二抗孵育，等体积混合ECL发光液(A、B液)后，滴于膜上蛋白面进行发光。以Quantity One进行灰度值分析。

1.2.4 qRT-PCR检测mRNA表达 依照试剂盒说明书进行细胞裂解及总RNA的抽提，对RNA纯度及浓度进行验证，进行qRT-PCR操作，反应体系如下：SYBR Green、DEPC处理水、cDNA模板、引物，总体积为20 μl。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共50个循环，采用△△Ct法分析结果。

1.2.5 以miR-505拟似剂或miR-505抑制剂转染MHCC97/ADM细胞 miR-505拟似剂或miR-505抑制剂转染MHCC97/ADM细胞，对miR-505表达进行上调或下调。将不进行转染的MHCC97/ADM细胞作为对照组。将各组细胞接种至6孔板，细胞密度达到60%以上时，以脂质体2000分别转染 miR-505拟似剂或miR-505抑制剂。配置混合液如下：混合液A：75 μl脂质体 2000试剂混合125 μl低血清培养基；混合液B：2 μl拟似剂或抑制剂与4 μl P2000(质粒转染试剂)试剂混合125 μl低血清培养基；混合液C：125 μl混合液A混合125 μl的混合液B，于室温静置5 min；250 μl混合液C加入6孔板的1个孔，轻微水平摇匀。转染24 h提取总RNA，以qRT-PCR进行转染效率验证。

1.2.6 流式细胞法检测MHCC97及MHCC97/ADM细胞凋亡 取处于对数期转染48 h的MHCC97及MHCC97/ADM细胞，采用Annexin V-FITC/PI双染色凋亡检测试剂盒进行凋亡检测，按照试剂盒说明书，悬浮细胞置于10 ml离心管中，以1×106细胞/ml为样本，顺序进行弃上清、洗涤、离心及细胞重悬，孵育后再离心，以细胞孵育缓冲液再洗涤，4 ℃下加荧光溶液孵育，避光振动后在流式细胞仪上进行待测样本检测，通过Cell Quest软件分析结果，凋亡率=早期凋亡细胞百分比+晚期凋亡细胞百分比，实验重复3次。

1.2.7 双荧光素酶报告检测miR-505与HMGB1靶向关系 采用pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体进行3′-UTR荧光素酶测定。首先使用脂质体 2000，用miR-505 拟似剂、miR-505抑制剂及阴性对照分别与pmirGLO双荧光素酶HMGB1表达载体共转染MHCC97细胞。转染18 h后吸尽培养基，对细胞用PBS洗涤3次，吸除PBS。以裂解缓冲液裂解细胞并覆盖细胞。对双荧光素酶检测程序进行设定，50 μl LAR Ⅱ及10 μl细胞裂解液加入到1.5 ml的EP管内并进行吹打混匀，上机记录萤光素酶反应强度为RLU1。结束测量后取出EP管，置入50 μl的Stop & Glo®Reagent 并吹打混匀，后再次上机为内参海肾萤光素酶强度RLU2，RLU1/RLU2=萤光素酶相对强度。

2 结果

2.1 ADM耐药肝癌细胞的IC50及耐药指数 以MTT法在培养48 h对肝癌细胞及耐药细胞的IC50进行检测，结果显示，亲代细胞株随着ADM浓度的升高细胞存活率降低，抑制率升高，MHCC97细胞株的IC50值为(1.25±0.13) mM(见图1A)；随着ADM浓度的升高，耐药细胞株细胞存活率降低较慢，抑制率升高也较慢，MHCC97/ADM的IC50值为(41.78±5.41) mM，耐药指数(Resistance index，RI)为33.25。IC50耐药细胞与亲本细胞比较，差异具有统计学意义(t=12.981,P=0.001)(见图1B)。

图1 不同浓度ADM对肝癌亲代细胞株及ADM耐药细胞株生存率的影响

2.2 MHCC97亲代细胞及耐药细胞miR-505及HMGB1表达差异 qRT-PCR显示，与MHCC97亲代细胞比较，MHCC97耐药细胞miR-505表达下调，HMGB1 mRNA表达上调(t=11.49,P<0.001；t=10.57,P<0.001)，见图2A；Western blot显示，与MHCC97亲代细胞比较，MHCC97耐药细胞HMGB1蛋白表达上调(t=9.47，P<0.001)(见图2B)。

图2 MHCC97亲代细胞及耐药细胞miR-505及HMGB1表达差异

2.3 转染效率检测 以qRT-PCR检测转染效率，结果显示，分别与阴性对照组比较，miR-505 拟似剂及miR-505抑制剂组差异具有统计学意义(t=9.732，P<0.001；t=24.73，P<0.001)。转染miR-505 拟似剂后MHCC97/ADM细胞miR-505表达约提高3.5倍，转染miR-505抑制剂后，miR-505表达约下降85%，转染效率满意，见图3。

图3 qRT-PCR检测miR-505拟似剂及miR-505抑制剂转染细胞的转染效率

2.4 miR-505表达水平对ADM耐药MHCC97细胞的影响 以miR-505拟似剂或miR-505抑制剂对MHCC97阿霉素耐药细胞株进行转染，以MTT法检测细胞存活率，结果显示，上调miR-505表达MHCC97/ADM存活率降低，与阴性对照组[IC50=(41.56±5.4)mM]比较，IC50降至(23.05±3.88) mM，差异有统计学意义(t=4.873，P=0.008)；RI自33.25降至17.24。下调miR-505表达MHCC97/ADM存活率升高，与阴性对照组比较，IC50升至(80.28±11.34) mM(t=5.956，P=0.004)，RI自33.25升至64.22，见图4A；在MHCC97/ADM细胞株，qRT-PCR显示，与阴性对照组比较，上调miR-505表达，HMGB1 mRNA表达下降(t=12.22，P<0.001)，下调miR-505表达，HMGB1mRNA表达上调(t=2.833，P=0.047)见图4B。Western blot显示，与阴性对照组比较，上调miR-505表达，HMGB1蛋白表达下降(t=12.74,P<0.001)，下调miR-505表达，HMGB1蛋白表达升高(t=3.289，P=0.030)，见图4C。表明上调miR-505表达能够部分逆转MHCC97阿霉素耐药细胞株耐药性，miR-505对HMGB1具有负向调控作用。

2.5 miR-505表达水平对ADM耐药MHCC97细胞凋亡的影响 以miR-505拟似剂或miR-505抑制剂对MHCC97阿霉素耐药细胞株进行转染，以流式细胞术检测MHCC97/ADM细胞凋亡率，结果显示，阴性对照组、miR-505抑制剂组及miR-505 拟似剂组凋亡率分别为29.88%±5.06%、16.79%±3.79%及40.73%±4.10%(P<0.05)，分别与阴性对照比较，miR-505抑制剂组凋亡率下降(t=3.582,P=0.023)，miR-505拟似剂组凋亡率升高(t=2.885，P=0.045)，见图5。表明上调miR-505表达能够逆转MHCC97/ADM的耐药性，增加耐药细胞株凋亡率。

2.6 双荧光素酶实验检测miR-505与HMGB1靶向关系 通过生物信息学技术(Targetscan、miRDB数据库)预测在HMGB1的3′UTR端位置417-424存在miR-505的结合位点，见图6A；荧光素酶报告显示，miR-505拟似剂转染在MUT细胞没有改变HMGB1的3′UTR的荧光素酶活性，在WT细胞降低了HMGB1的3′UTR的荧光素酶活性，具有靶向调控关系(t=14.54，P<0.001)，见图6B。

图4 miR-505表达水平对MHCC97细胞ADM耐药及HMGB1蛋白表达的影响

图5 上调或下调miR-505表达对MHCC97/ADM细胞凋亡的影响

图6 miR-505与HMGB1具有靶向调控位点

3 讨论

肝细胞癌的发病机制是多信号通路多基因共同作用的结果，化疗及靶向药物在一定程度上提高了晚期肝癌治疗的无病生存期及总生存期，改善了患者预后，但原发性耐药和继发性耐药仍然是影响预后的重要因素[8]。阿霉素属于蒽环类，可以破坏肿瘤细胞DNA，激活p53，从而加速细胞衰老、增加凋亡、减弱存活，广泛应用在肉瘤、结直肠癌、肝癌及胰腺癌等实体肿瘤的治疗中[9-10]。miRNA在多种实体肿瘤阿霉素耐药调控中具有重要作用，研究显示，miR-199a-5p在Circfoxo3调控下介导肝癌细胞阿霉素耐药[11]，miR-222通过抑制p27表达，逆转乳腺癌细胞阿霉素耐药[12]，上调miR-132表达，逆转结直肠癌细胞阿霉素耐药[13]。我们在前期研究中证实，miR-505在肝癌细胞中表达下调，为抑癌基因，对HMGB1具有靶向调控作用，抑制肝癌细胞侵袭、增殖及促进凋亡等行为，可能对阿霉素诱导的肝癌细胞毒性具有促进作用[7]。根据前期研究，本实验进一步观察了miR-505对阿霉素耐药肝癌细胞的作用。

3.1 miR-505及HMGB1表达与MHCC97细胞耐药相关 本研究显示，与亲代细胞株比较，ADM耐药肝癌细胞RI达到33.25，耐药细胞中miR-505表达下调，而HMGB1 mRNA及蛋白表达上调。表明miR-505及HMGB1表达可能与MHCC97细胞耐药相关。为了进一步观察miR-505与MHCC97细胞耐药的相关性，在进一步研究中对miR-505在耐药细胞株中的表达进行了上调或下调，结果显示，上调miR-505表达，MHCC97/ADM存活率降低，耐药指数下降，下调miR-505表达，MHCC97/ADM存活率升高，耐药指数上升，这部分研究进一步表明，miR-505可能对肝癌细胞耐药具有逆向调控作用。Wang等[14]研究显示，在胃癌细胞，miR-505受到长链非编码RNA CRAL调控，逆转顺铂耐药。Chen等[15]研究认为，miR-505通过靶向调控RASSF8表达，介导结肠癌细胞甲氨蝶呤耐药。以上研究均表明，在实体肿瘤耐药机制中miR-505具有重要的调控作用。

3.2 miR-505靶向调控HMGB1表达介导肝癌细胞阿霉素耐药 本研究进一步显示，在MHCC97/ADM细胞株，上调miR-505表达，HMGB1 mRNA及蛋白表达下降；下调miR-505表达，HMGB1 mRNA及蛋白表达上调。这表明miR-505对HMGB1在RNA水平发挥调控作用，这与我们前期在MHCC97及HepG2亲代肝癌细胞中的研究结果一致[7]，进一步验证了miR-505及HMGB1表达对肝癌细胞阿霉素耐药具有调控作用。有研究显示，在骨肉瘤中miR-505通过HMGB1抑制肿瘤细胞增殖[16]，在肾癌中miR-505通过HMGB1发挥抑癌基因作用[17]。

3.3 上调miR-505靶向抑制HMGB1促进阿霉素耐药肝癌细胞株凋亡 本研究进一步显示，上调miR-505能够增加耐药细胞株凋亡率，在HMGB1的3′UTR端存在miR-505的结合位点。前期研究显示，在亲代MHCC97及HepG2肝癌细胞中，miR-505通过靶向抑制HMGB1调控增殖及侵袭[18]。以上研究均表明，miR-505对HMGB1具有负向调控作用。由于阿霉素通过芳香平面结构在DNA碱基对之间形成嵌入结构，对DAN拓扑异构酶Ⅱ产生抑制作用，造成DNA损伤，从而激活p53，诱发细胞周期停滞[19]。miRNA能够通过下游通路调控DNA同源重组，从而影响细胞阿霉素耐药[20]。

本研究通过构建肝癌细胞阿霉素耐药细胞株，并观察miR-505对耐药细胞株耐药指数及凋亡变化的影响，探讨肝癌细胞阿霉素耐药的机制，发现上调miR-505表达通过靶向抑制HMGB1逆转阿霉素耐药肝癌细胞株耐药性，促进凋亡，为进一步研究miR-505在肝癌发病及进展中的作用及机制建立了研究基础。